茯苓多糖的純化及分子量測定

顏 軍，陶 濤，孫曉春，何 鋼，易 勇，茍小軍，

(1.成都大學 藥食同源植物資源開發重點實驗室，四川 成都 610106；2.四川抗菌素工業研究所，四川 成都 610052)

茯苓(Poriacocos)是我國傳統的名貴中藥材，主產云南(云苓)、安徽(安苓)、貴州、廣西、湖北、福建(閩苓)等地[1]，為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，屬擔子菌綱真菌，具有滲濕、健脾、利尿等功能[2]。

茯苓的主要有效成分為茯苓多糖(Tuckahoe polysaccharide, TAP)，約占茯苓菌核干重的70%～90%[3，4]。茯苓異多糖具有促進細胞分裂、補體激活、誘變、抗腫瘤、抗癌、增強免疫性等生物活性[5～7]，可廣泛應用于醫療保健、食品等領域，具有廣闊的開發應用前景。茯苓多糖結構及生物活性的研究也逐漸得到重視[8，9]。

目前，有對茯苓多糖進行化學修飾后測定其分子量的報道[10]，而對茯苓多糖純化后進行分子量測定的報道較少。多糖分子量的測定方法有凝膠滲透色譜和光散射聯用法(GPC-LS)[11]、高效凝膠排阻色譜法[12，13]、手工裝填的凝膠柱色譜法[14]。手工柱色譜法測定的穩定性和重現性差，造成分子量測定的偏差。作者從茯苓中提取水溶性多糖、去蛋白質后用DEAE-650C層析柱進行分離純化，對純化后的茯苓多糖采用高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)進行分子量的測定。為深入研究茯苓多糖的生物活性及在食品與醫療保健中進一步開發利用提供了可行性依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

白茯苓，購自成都荷花池藥材市場，粉碎，過40目篩。

DEAE-650C層析柱，廣州市齊云生物技術有限公司。標準系列葡聚糖Dextran (T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000)、葡萄糖、苯酚、硫酸、氯仿、正丁醇、乙醇等，均為國產分析純。

L-2490型HPLC(RI檢測器)，日本日立；GL-21M 型高速冷凍儀，湘儀；UV/VIS 280PC型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；BS-100A型自動部分收集器、TH-300型梯度混合器、HL-2B型恒流泵，上海青浦滬西儀器廠；電子天平，上海越平科學儀器有限公司。

1.2 茯苓粗多糖的提取[12]

稱取一定量茯苓粉，加入4～6倍量的水，熬煮3次，提取時間分別為3 h、2 h、1 h，過濾，合并3次提取液，減壓濃縮至適量，在攪拌下加入95%的乙醇，使其含醇量達到80%，靜置過夜。析出褐色沉淀后，1000 r·min-1離心10 min，得沉淀，低溫干燥，即得茯苓粗多糖。

1.3 茯苓粗多糖的精制

采用Sevag 法反復除蛋白。取茯苓粗多糖溶液4 mL，加入氯仿和正丁醇1 mL[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]，充分振蕩20 min，離心去除水層與溶劑層交界處的變性蛋白，反復數次，直至溶劑層與水的界面無乳白色沉淀為止。

1.4 茯苓多糖的純化

將DEAE-650C層析柱水平衡后，取200 mg精制多糖樣品溶解于蒸餾水中上樣，蒸餾水洗脫60 mL后，以0～3 mol·L-1NaCl溶液梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，每管收集2 mL，分布收集、備用。硫酸-苯酚法檢測多糖含量。

1.5 多糖含量的測定[15]

硫酸-苯酚顯色液的配制：用50 mL濃硫酸和10 mL水配制實驗用硫酸溶液，并加入0.6 g苯酚，配制成顯色液。

顯色方法：移取1.00 mL待測樣品于試管中，加入5.00 mL顯色液，振蕩混勻。置于沸水浴中保溫30 min，立即置于冷水浴中，冷卻至室溫。以未加葡萄糖溶液作為空白對照。于490 nm處測定系列葡萄糖溶液的吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。測定樣品溶液490 nm處吸光度，據標準曲線計算多糖含量。

1.6 分子量的測定

采用高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)進行分子量的測定。

色譜條件：色譜柱：YMC Pack-Diol 200柱(300 mm×8.0 mm，S-5 μm，20 nm)；流動相：蒸餾水；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：35℃；檢測器：示差折光檢測器；進樣量：20 μL。

標準曲線的繪制：以系列葡聚糖T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000和葡萄糖為標準品，分別用流動相溶解配制成2 mg·mL-1溶液進樣，記錄洗脫峰的保留時間。分子量Mw與其在凝膠柱上的洗脫體積Ve、分配系數Kav存在如下關系：

Ve=a-blgMw

Kav=K1-K2lgMw

Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)

式中：a、b、K1、K2為常數；V0為T-2000的洗脫體積；Vt為葡萄糖的洗脫體積，均以保留時間表示。

以Kav對lgMw進行線性回歸處理，得線性回歸方程。樣品按上述條件上柱，求得Ve，根據其Kav值從標準曲線上求得樣品的分子量。

2 結果與討論

2.1 茯苓多糖的提取

稱取茯苓粉末100 g，采用水提醇沉法提取茯苓多糖，得茯苓粗多糖2.1 g，提取率為2.1%。

2.2 純度鑒定

采用紫外掃描法對除蛋白前后的茯苓多糖溶液進行純度鑒定，波長范圍190～600 nm，紫外掃描結果見圖1。

圖1 茯苓多糖溶液紫外掃描圖譜

由圖1可以看出，在270～290 nm處，吸收明顯減少，說明Sevag法對茯苓粗多糖中蛋白雜質的去除效果較好。取茯苓粗多糖2 g，采用Sevag 法去雜質，得精制茯苓多糖1.3 g，純化率為65%。

2.3 DEAE-650C柱層析

將精制多糖溶液進行DEAE-650C柱分離，硫酸-苯酚法顯色檢測，洗脫曲線見圖2。

1.TAP1 2.TAP2

由圖2可知，DEAE-650C柱層析后得兩個洗脫峰，且峰的對稱性較好。分別合并10～20管和50～61管的多糖洗脫液，透析后凍干，得茯苓多糖兩個組分。峰1為蒸餾水洗脫所得，初步判斷為中性多糖組分，命名為TAP1；峰2為NaCl溶液梯度洗脫所得，初步判斷為酸性多糖組分，命名為TAP2。

2.4 分子量測定

按1.6方法測定系列標準葡聚糖溶液的保留時間見表1。計算出各分子量標準品的lgMw和Kav，以Kav對分子量的對數作圖，結果見圖3。多糖分子量在10 000 ～500 000范圍內與Kav呈良好線性關系，得回歸方程為y=-3.8951x+6.0471，R2=0.9994。

表1 不同分子量標準品的高效凝膠過濾色譜保留時間

圖3 葡聚糖標準曲線

將茯苓多糖兩組分TAP1和TAP2溶于蒸餾水中制成質量體積比為2%的溶液，在相同色譜條件下進樣分析，保留時間分別為9.820 min和8.473 min。通過回歸方程計算得出分子量分別為11 721和44 065。

3 結論

用水提醇沉法對茯苓多糖進行提取，工藝流程簡便，提取的粗多糖易純化，但多糖得率低，僅為2.1%。茯苓提取工藝還待進一步研究。用Sevag法脫蛋白，其條件溫和且不引起多糖的降解，但需要重復多次。本實驗采用5次Sevag法脫蛋白，紫外掃描檢測表明去除效果較好，純化率為65%。

精制茯苓多糖經DEAE-650C柱層析分離、純化，獲得TAP1和TAP2兩個多糖組分。TAP1為蒸餾水洗脫所得，初步判斷為中性多糖組分；TAP2為NaCl溶液梯度洗脫所得，初步判斷為酸性多糖組分。采用高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)測定，中性茯苓多糖TAP1和酸性茯苓多糖TAP2的分子量分別為11 721、44 065。

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