微生物碳酸酐酶在礦化沉積中的研究進展

張小菊，楊 娟，李橫江

(華中科技大學武昌分校城市建設學院，湖北 武漢 430064)

碳酸酐酶(Carbonic anhydrase，CA)是生物體內普遍存在的一種金屬酶，其活性中心中含有一個催化活性所必需的鋅原子，催化CO2進行可逆水合反應，在礦化沉積中扮演著重要的角色[1，2]。

生物礦化沉積是一種廣泛而復雜的固液之間、有機物和無機物之間的物理化學過程，是以少量有機質為模板，進行分子操作，高度有序地組合成無機材料，構成礦物質點的形態大小、空間排列、結晶取向和同質多晶類型[3]。目前石質文物的人為破壞作用、微生物破壞作用、風化作用嚴重，對石質文物進行保護的研究主要集中在石質文物微生物的腐蝕機理[4]、石質文物的防風化、利用生物礦化的原理在石材表面仿生合成保護材料[5～7]等。已有研究微生物誘導的礦化作用對碳酸鈣形成的影響及遺產保護的相關報道[8～10]，但利用生物的礦化沉積特別是碳酸酐酶的作用來修復石質文物還研究得較少。

作者主要綜述了微生物碳酸酐酶在礦化沉積中的研究進展及在環境生物修復、石刻文物保護中的應用價值，并對其研究進行了展望。

1 微生物碳酸酐酶在礦化沉積中的研究現狀

有關植物碳酸酐酶、微生物碳酸酐酶的研究報道均較多，探討了碳酸酐酶在巖溶環境中的分布、活性、穩定性、與生態系統元素遷移之間的關系等[11～13]。研究表明，植物的根系、土壤中的微生物等都是碳酸酐酶的重要來源，其活性與地球化學環境等關聯性強[14]。

目前，有關微生物碳酸酐酶引起的礦化沉積作用還研究得較少。因微生物碳酸酐酶催化的是CO2的可逆水合反應，反應生成的H+會影響CaCO3的電離平衡，反應式如下：

(1)

由此可知，研究碳酸酐酶在鈣化沉積中的作用，對環境修復或制備碳酸鹽晶體等有重要意義。

有關碳酸酐酶與鈣化沉積的關系早在十幾年前就有研究，主要集中在海洋生物的鈣化沉積等方面。

Miyamoto等[15]首次報道在牡蠣珍珠層的一種可溶性有機基質蛋白質中發現了2個功能域：一個是CA，一個是 Gly-Xaa-Asn(Xaa=Asp或 Glu)重復域。CA域被Gly-Xaa-Asn重復域插入分成2個子域，其重復的Gly-Xaa-Asn域可能連接鈣，同時碳酸酐酶由于催化上述反應而參與了珍珠層 CaCO3晶體的形成。

Watanabe等[16]從珊瑚的外骨骼化鈣化組織中提取生物的有機基質，從中分離出46 kDa的蛋白質，對其氨基酸序列進行分析，發現該蛋白質的內部序列與 CA的部分序列類似，進一步證實了碳酸酐酶能促進鈣化沉積。

Beiner等[17]對魚類耳石礦化形成的早期階段碳酸酐酶所起的重要作用進行了研究，認為在耳石播種的很早階段，CA可能有助于前體顆粒的增長過程。

Rahman等[18]研究了珊瑚內骨骼硬化組織中CA的新的活性，并研究了CA與鈣化硬組織形成之間的關系，認為CA域參與了鈣化過程，能控制CaCO3晶體的形貌。

珊瑚中的基質蛋白質不僅是一種結構蛋白，而且是一種催化劑，可促進鈣化沉積。Rahman等[19]研究表明，酸性蛋白在控制礦物的形成和發展中發揮重要作用。鑒定不溶性有機基質中酸性蛋白及其作用對于理解珊瑚中個體蛋白的功能非常重要。分析短指多型軟珊瑚(Sinularia polydactyla)的可溶性和不溶性基質層中蛋白組分表明，不溶性基質和可溶性基質層中天冬氨酸的含量分別是61%和29%。利用體外分析法發現，基質蛋白誘導碳酸鈣形成非晶態析出相先于其形成鈣質的結晶態。對不溶性基質組分分析顯示一個分子量為109 kD的蛋白質可以與形成骨片的鈣離子結合，這一過程對骨片形成非常重要。對在生物鈣化過程中起重要作用的碳酸酐酶的分析表明了此酶的新的活性。以上結果表明珊瑚中不溶性基質內富含天冬氨酸的蛋白在生物礦化調控過程中起重要作用。

有關碳酸酐酶對CaCO3晶體生物沉積的調控作用也有一些研究，主要通過購買純牛CA進行模擬實驗，結果發現轉換反應(2)是CaCO3晶體沉積的限速步驟，但CA的調控機理有待進一步研究。

(2)

2 微生物碳酸酐酶的應用價值

通過涂抹工藝和注入工藝的實踐，可在材料表面原位礦化沉積出方解石，增強了微生物修復在實際工程中應用的可操作性。王瑞興等[22]以瓊脂作為載體，采用涂刷技術將菌株和營養物質固載于水泥石表面，創造菌株生長、酶化和碳酸鈣沉積的微環境，7 d后能在水泥石表面緊密附著生成厚度100 μm左右的碳酸鈣膜，同時將高濃縮菌株與砂基材拌合，并混合尿素和Ca2+，制備成漿體，注入到水泥石人造裂縫中，通過定時滴加修復營養液的方法，逐漸在裂縫砂粒之間礦化沉積出碳酸鈣，最終將砂粒緊密膠結在裂縫內，達到裂縫修復的目的。

微生物碳酸酐酶促進碳酸鹽沉積應用前景還體現在生物礦化的CaCO3晶體，可作為吸附材料、催化材料、陶瓷材料、敏感介質(如酶、蛋白質)保護材料、藥物緩釋材料等，在化工、環保、生物、醫藥和建材等領域有著廣泛的應用前景；還可以應用于工程如混凝土微裂縫修復、古建筑表面防護處理、微納米碳酸鈣顆粒制備等；其對石質景觀的保護與修復、穩固地基、預防地震、捕獲放射性核素和重金屬離子等作用也不容忽視。

3 微生物碳酸酐酶的研究展望

鑒于微生物碳酸酐酶在礦化沉積中的重要作用，今后的研究要致力于掌握微生物碳酸酐酶誘導碳酸鹽沉積或礦化機理，明確其關鍵問題，如碳酸鹽沉積過程中，CaCO3晶體成核、生長、結構的堆積方式、碳酸鹽的大小和形態等，并掌握其調控機制；可研究來自不同有機體如植物、微生物的CA是否對CaCO3的沉積產生不同的影響；探索具有特定形態的晶體對環境污染的生物治理和修復的應用策略；以生物化學和基因工程為研究手段探討微生物碳酸酐酶促進生物礦化的長期過程中的動力學效應、取向生長、原位合成、重要影響因素等，為石質文物表面保護和生物修復提供更多新的途徑。

[1]曾憲東.植物碳酸酐酶對石灰巖巖溶的驅動作用研究[D].武漢：華中科技大學，2004.

[2]王倩，支崇遠.硅藻碳酸酐酶對石灰巖巖溶的作用及其生態意義[J].上海地質，2007，(4)：25-27.

[3]姜國良，陳麗，劉云.貝殼有機基質與生物礦化[J].海洋科學，2002，26(6)：16-18.

[4]Mann S，Heywood B R，Rajam S，et al.Controlled crystallization of calcium carbonate under stearic acid monolayers[J].Nature，1988，334 (6184)：692-695.

[5]王成毓，趙敬哲，劉艷華，等.模擬生物礦化過程原位合成活性納米碳酸鈣[J].高等學校化學學報，2005，26(1)：13-15.

[6]張秉堅，周環，賀筱蓉.石質文物微生物腐蝕機理的研究[J].文物保護與考古科學，2001，13(2)：15-19.

[7]劉強，張秉堅.石質文物表面生物礦化保護材料的仿生制備[J].化學學報，2006，64(15)：1601-1605.

[8]王麗琴，黨高潮，梁國正.露天石質文物的風化和加固保護探討[J].文物保護與考古科學，2004，16(4)：58-63.

[9]邵高峰.環保型石質文物防風化劑的制備及性能研究[D].北京：北京化工大學，2007.

[10]周雪瑩，杜葉，連賓.不同培養條件對膠質芽孢桿菌誘導碳酸鈣晶體形成的影響[J].微生物學報，2010，24(7)：26-31.

[11]李強，靳振江，孫海龍.現代藻類碳酸鈣沉積試驗及其同位素不平衡現象[J].中國巖溶，2005，24(4)：261-264.

[12]李沛豪，屈文俊.細菌誘導礦化保護歷史建筑遺產的機理及效果[J].硅酸鹽學報，2009，12(4)：482-486.

[13]曾憲東，余龍江，李為，等.西南巖溶地區黃荊葉片碳酸酐酶的穩定性[J].植物學通報，2005，22(2)：169-174.

[14]戴新賓，翟虎渠，張紅生，等.土壤干旱對水稻葉片光合速率和碳酸酐酶活性的影響[J].植物生理與分子生物學學報，2000，26(2)：133-136.

[15]Miyamoto H，Miyashita T, Okushima M, et al.A carbonic anhydrase from the nacremous layer in oyster pearls[J].Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America，1996，93(5)：9567-9660.

[16]Watanabe T, Fududa I, Isa Y, et al.Molecular analyses of protein components of the organic matrix in the exoskeleton of two scleractinian coral species[J].Comparative Biochemistry and Physiology.Part B：Biochemistry & Molecular Biology，2003，136，B(4)：767-774.

[17]Beiner M，Anken R.On the role of carbonic anhydrase in the early phase of fish otolith mineralization[J].Advances in Space Research，2006，38(7)：1119-1122.

[18]Rahman M A，Oomori T，Uehara T.Carbonic anhydrase in calcified endoskeleton：Novel activity in biocalcification in alcyonarian[J].Marine Biotechnology，2008，28(10)：31-38.

[19]Rahman M A, Oomori T.不溶性基質中天冬氨酸豐富的蛋白在珊瑚的鈣質骨片形成中的重要作用[J].生物工程學報，2008，(12)：2127-2128.

[20]李強.水生藻類碳酸酐酶(CA)對碳酸鈣沉積速率控制的試驗研究[D].南寧：廣西師范大學，2004.

[21]李為，劉麗萍，曹龍，等.碳酸鹽生物沉積作用的研究現狀與展望[J].地球科學進展，2009，24(6)：597-605.

[22]王瑞興，錢春香.微生物沉積碳酸鈣修復水泥基材料表面缺陷[J].硅酸鹽學報，2008，36(4)：457-464.