靈芝多糖體外抗氧化活性的研究

張志軍，李淑芳，魏雪生，陳曉明

(天津市林業(yè)果樹研究所，天津 300112)

在生物體生命活動的氧化代謝過程中不斷產生各種自由基。自由基不僅是生物體多種生理功能的啟動因素和生化反應的介導者，同時也在免疫細胞因子網(wǎng)絡中起調節(jié)、信號轉導作用[1]。現(xiàn)代生命科學、醫(yī)學研究表明，隨著年齡的增長，人類機體內自由基的自穩(wěn)態(tài)平衡性下降，從而導致自身免疫功能下降，發(fā)生腫瘤、動脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓、Alzheimer型早老性癡呆等自由基疾病[2，3]。

靈芝(Ganodermalucidum)在我國自古就有“仙草”的美譽，已有悠久的藥用和食用歷史，《神農本草經》、《本草綱目》中都有靈芝的藥效記載[4]。多糖是靈芝中的主要活性組分之一。20世紀70年代以來，靈芝多糖的研究開發(fā)進入了一個嶄新的發(fā)展時期，經過近30年的發(fā)展，人們對靈芝多糖這一重要生命物質產生了新的認識[5]。據(jù)報道，從雙孢蘑菇、靈芝、香菇、側耳等6種真菌中提取出的活性成分，可以防止細胞內DNA的氧化損傷。劉志峰等研究證明，蘑菇提取物對脂質過氧化的抑制率可達29%。真菌提取物對自由基有一定的清除作用[6]。真菌是自由基清除劑的良好載體。而多糖是真菌中的主要活性成分。

目前，國內外基本上采用水浸法、堿浸法提取多糖，再經有機溶劑沉淀提純。由于傳統(tǒng)工藝采用堿浸、有機溶劑分離提純等手段，易對靈芝多糖聚合體造成破壞，也易造成某些活性基團變性失活，且粗多糖提取效率極低。膜分離技術是近年來發(fā)展起來的在分子水平上實現(xiàn)機械分離的高新技術，由于其具有常溫操作、無相態(tài)變化、高效節(jié)能、無污染等特點，且整個分離過程在密閉系統(tǒng)中進行，可避免和減輕熱和氧對物料營養(yǎng)成分的破壞，因此，被認為是21世紀最有前途的技術。采用膜技術進行靈芝多糖的分離純化，不僅收率高而且極少破壞靈芝多糖結構[7]。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

靈芝，天津市林業(yè)果樹研究所。

鄰苯三酚、番紅花T、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等，均為分析純。

恒溫水浴箱，752型分光光度計。

1.2 靈芝多糖的提取

(1)水提醇沉工藝

靈芝子實體→粉碎→粗濾→真空濃縮→醇沉→干燥

(2)膜分離工藝

靈芝子實體→粉碎→預煮→粗濾→微濾→超濾→濃縮干燥

1.3 性能測試

1.3.1 還原能力測定(鐵氰化鉀還原法)

在2.5 mL pH值6.6的磷酸緩沖溶液中加入1 mL樣品、2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合物在50℃恒溫條件下加熱20 min，急速冷卻，加2.5 mL 10%三氯乙酸，3000 r·min-1離心分離，取上層清液2.5 mL，加2.5 mL水，再加0.5 mL 0.1% FeCl3，混合均勻，靜置10 min后在波長700 nm下測吸光度A700。A700值越大，則樣品的還原能力越強。

1.3.2 對羥自由基(·OH)的清除作用

根據(jù)Fenton反應原理，H2O2在Fe2+存在時生成·OH，反應式如下：

·OH可使番紅花T褪色，即在520 nm處可測出·OH的生成情況，進而檢測出加入樣品的抗氧化活性。反應體系終體積4.5 mL，其中含150 mmol·L-1硫酸鈉鹽緩沖溶液(pH值7.4)、114 μmol·L-1番紅花T、1.927 mmol·L-1EDTA·Na2、1.0 mmol·L-1硫酸亞鐵、3% H2O2以及不同濃度的樣品，在37℃恒溫水浴30 min后，加入0.3 mmol·L-1EDTA·Na2終止反應，以緩沖溶液作參比，在520 nm處檢測其OD值。空白組以0.1 mL蒸餾水替代樣品，對照組以1.5 mL蒸餾水替代樣品和EDTA·Na2。按式(1)計算清除率：

(1)

(2)

2 結果與討論

2.1 靈芝多糖的還原能力測定

鐵氰化鉀還原法的原理為：

在波長700 nm條件下測定吸光度A700，結果見表1。

表1 靈芝多糖的還原能力

由表1可知，0.10 mg·mL-1靈芝多糖溶液的A700值與水體系A700值相當，說明該濃度(均指加入反應體系的樣品起始濃度，下同)下靈芝多糖沒有還原能力。隨著濃度的增大，A700值也增大，多糖的還原能力在實驗濃度范圍內有較好的量效關系。以30 μg·mL-1Vc溶液的還原能力作參比，1.00 mg·mL-1多糖溶液的還原能力強于Vc。以相同起始樣品濃度比較A700值，靈芝多糖還原能力明顯低于Vc的還原能力，但靈芝多糖溶液還原能力的存在說明靈芝多糖具有抗氧化作用的可能性。

2.2 靈芝多糖的清除自由基作用

2.2.1 不同工藝提取的多糖對·OH的清除作用(表2)

表2 不同工藝提取的多糖對·OH的清除作用

由表2可知，隨著靈芝多糖濃度的增加，對Fenton反應體系產生的羥自由基的清除率相應增大，且量效關系非常明顯。在相同濃度下，膜分離工藝提取的靈芝多糖清除羥自由基的能力強于傳統(tǒng)的水提醇沉工藝，IC50分別為1.36 mg·mL-1、1.58 mg·mL-1。

表3 不同工藝提取的多糖對·的清除作用

由表3可知，隨著靈芝多糖濃度的增加，對鄰苯三酚自氧化體系產生的超氧陰離子自由基的清除率相應增大，且量效關系非常明顯。在相同濃度下，膜分離工藝提取的靈芝多糖清除超氧陰離子自由基的能力強于傳統(tǒng)的水提醇沉工藝，IC50分別為2.55 mg·mL-1、2.83 mg·mL-1。

綜上所述，膜分離工藝提取的靈芝多糖清除自由基的能力強于傳統(tǒng)水提醇沉工藝。這是因為，在靈芝多糖的提取過程中，傳統(tǒng)工藝采用了有機溶劑和多次高溫處理，使多糖的生物活性受到影響。

3 結論

(1)靈芝多糖濃度在0.10 mg·mL-1時，其A700值與水體系相當，沒有還原能力；在1.00 mg·mL-1時，多糖溶液的還原能力強于30 μg·mL-1的Vc溶液；以相同起始樣品濃度比較A700值，靈芝多糖還原能力明顯低于Vc的還原能力。但靈芝多糖溶液還原能力的存在說明靈芝多糖具有抗氧化作用的可能性。

(2)對不同工藝提取的靈芝多糖的清除自由基能力進行比較，結果表明，膜分離工藝提取的靈芝多糖清除超氧陰離子自由基和羥自由基的能力均較好，并且清除能力和多糖濃度存在明顯的正相關量效關系。

[1]李榮芷，何云慶.靈芝抗衰老機理與活性成分靈芝多糖的化學與構效研究[J].北京醫(yī)科大學學報，1991，23(6)：473-475.

[2]趙國華，陳宗道，李志孝，等.活性多糖的研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27(7)：45-48.

[3]游育紅，林志彬.靈芝多糖肽的抗氧化作用[J].藥學學報，2003，38(2)：85-88.

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[5]藺麗，方能虎，吳旦，等.靈芝的主要生物活性研究概況[J].中國食用菌，2000，21(3)：38-40.

[6]肖建輝，蔣儂輝，梁宗琪，等.食藥用真菌多糖研究進展[J].生命的化學，2002，22(2)：148-151.

[7]劉建華，張志軍.靈芝多糖提取與應用現(xiàn)狀[J].保鮮與加工，2003，3(3)：9-10.