海產(chǎn)養(yǎng)殖餌料四爿藻的生長(zhǎng)評(píng)價(jià)

李紅麗，胡鴻鈞，李夜光，歐陽(yáng)葉新

(1.中南民族大學(xué)工商學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.中國(guó)科學(xué)院武漢植物研究所，湖北 武漢 430074)

四爿藻(Tetraselmis)是一類(lèi)單細(xì)胞綠藻[1]，因其特殊的系統(tǒng)位置和化學(xué)組成，近來(lái)受到國(guó)際學(xué)者的普遍關(guān)注[2]。四爿藻含葉綠素a、葉綠素b及豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，作為餌料廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[3～5]。四爿藻生活史包括運(yùn)動(dòng)的四鞭毛期(生物量累積時(shí)期)和不運(yùn)動(dòng)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞期(靜止相)，餌料生產(chǎn)要求收獲運(yùn)動(dòng)的四鞭毛期細(xì)胞。在人工大規(guī)模培養(yǎng)四爿藻餌料過(guò)程中，需要及時(shí)檢測(cè)四爿藻的生長(zhǎng)情況。目前，評(píng)價(jià)綠藻生長(zhǎng)狀況的方法主要有細(xì)胞計(jì)數(shù)法、活體細(xì)胞熒光法和葉綠素含量分光光度計(jì)檢測(cè)法[6]。其中活體細(xì)胞熒光法需要昂貴的儀器設(shè)備，理論復(fù)雜，人為誤差較大，實(shí)際運(yùn)用較少。細(xì)胞計(jì)數(shù)法較為可靠，但需要顯微鏡和專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行測(cè)定，而且運(yùn)用比較麻煩，不適合普通人員進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)采用。藻類(lèi)細(xì)胞含有進(jìn)行光合作用的捕光色素分子和代謝衍生物，利用其特征光密度吸收值表示細(xì)胞密度已有大量報(bào)道[7]。作者在此對(duì)普遍采用的四爿藻生物量累積時(shí)期生長(zhǎng)狀況的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行比較，旨在尋找適合于評(píng)價(jià)四爿藻生活史運(yùn)動(dòng)時(shí)期細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快捷的方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用藻種為3個(gè)不同種的海洋四爿藻：朱氏四爿藻(TetraselmischuiWH01)、心形四爿藻 (T.cordiformisWH02)，采自山東省青島市沿海地區(qū)；大四爿藻(T.helgolandicaWH03)，采自浙江省象山縣。藻種由中科院武漢植物研究所藻種庫(kù)提供。

1.2 四爿藻的培養(yǎng)

將3種四爿藻藻種接種于改良的適合于水產(chǎn)養(yǎng)殖的四爿藻培養(yǎng)基[8]中，置于RH-150-G型恒溫光照培養(yǎng)箱中(20±2)℃下持續(xù)光照培養(yǎng)，光強(qiáng)2000～ 4000 lx，搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1。

1.3 四爿藻的生長(zhǎng)評(píng)價(jià)

1.3.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)

分別取待測(cè)的四爿藻培養(yǎng)物(培養(yǎng)前6 d)，用Lugol氏固定液固定，血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。每樣品重復(fù)4次，求平均值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 葉綠素含量測(cè)定

采用快速微量提取法進(jìn)行[6]，略作改動(dòng)。離心收獲不同生長(zhǎng)期的四爿藻培養(yǎng)物，加入 95%乙醇研磨(補(bǔ)足體積)后室溫下抽提4～6 h，離心取上清，乙醇重提，直至抽提充分(共抽提3次)。合并上清，用722型分光光度計(jì)檢測(cè)OD649和OD665值。根據(jù)下面公式計(jì)算葉綠素a(Chl a)、葉綠素b (Chl b)的含量(μg·mL-1)，每樣品重復(fù)4次，求平均值，繪制生長(zhǎng)曲線并與細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行比較 。

Chl a 含量 = 13.7×OD665-5.76×OD649

Chl b含量 = 25.8×OD649-7.6×OD665

1.3.3 特定光密度值測(cè)定

采用722型分光光度計(jì)直接測(cè)定四爿藻培養(yǎng)物在不同波長(zhǎng)(560 nm、625 nm、750 nm) 下的光密度值，繪制生長(zhǎng)曲線，并與細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行比較。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Origin v6.0 作圖，分析生長(zhǎng)曲線的差異，并對(duì)3種四爿藻據(jù)葉綠素a的平均含量繪制的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行回歸，并與細(xì)胞計(jì)數(shù)法得到的生長(zhǎng)曲線回歸結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 特定光密度值的測(cè)定結(jié)果與細(xì)胞計(jì)數(shù)法結(jié)果的比較(圖1)

圖1 朱氏四爿藻(A)、心形四爿藻(B)、大四爿藻(C)的生長(zhǎng)曲線(根據(jù)幾組特定光密度值繪制)

從圖1可看出，朱氏四爿藻的OD560、OD625、OD750變化，在前3 d與細(xì)胞數(shù)目的變化趨勢(shì)一致，均能反映生長(zhǎng)變化規(guī)律；第4～5 d也與細(xì)胞數(shù)目的變化趨勢(shì)基本一致，但稍微偏低；第5～6 d，細(xì)胞數(shù)目開(kāi)始減少，但OD560、OD625、OD750仍在增加，表現(xiàn)出與前者相反的變化趨勢(shì)。另外，OD560、OD625、OD750的變化趨勢(shì)差異不大。由此看來(lái)在第6 d朱氏四爿藻的OD560、OD625、OD750結(jié)果與細(xì)胞計(jì)數(shù)法結(jié)果有較大的出入，不能代表細(xì)胞計(jì)數(shù)法的結(jié)果。

心形四爿藻和大四爿藻的OD560、OD625、OD750變化與細(xì)胞計(jì)數(shù)法的結(jié)果比較，表現(xiàn)出與朱氏四爿藻類(lèi)似的變化規(guī)律。這說(shuō)明OD560、OD625、OD750變化與四爿藻藻種的差異性關(guān)系不明顯(P=0.005)。

2.2 葉綠素a 和葉綠素b的測(cè)定結(jié)果與細(xì)胞計(jì)數(shù)法結(jié)果的比較(圖2)

圖2 朱氏四爿藻(A)、心形四爿藻(B)、大四爿藻(C)的生長(zhǎng)曲線(根據(jù)葉綠素a、b含量繪制)

從圖2可看出，朱氏四爿藻前6 d的葉綠素a含量變化與細(xì)胞數(shù)目變化基本一致，而葉綠素b含量變化則或多或少呈現(xiàn)出一定的波動(dòng)性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是如此。因此，葉綠素b含量變化不如葉綠素a含量變化規(guī)則，這說(shuō)明葉綠素a含量變化與細(xì)胞數(shù)目變化較為吻合。心形四爿藻和大四爿藻也得到了類(lèi)似的結(jié)論。這說(shuō)明葉綠素a、b含量變化與四爿藻藻種的差異性變化關(guān)系不顯著(P=0.005)。

2.3 葉綠素a含量變化的回歸曲線分析

鑒于葉綠素a含量變化與四爿藻藻種差異性不顯著，將3種四爿藻的葉綠素a平均含量求對(duì)數(shù)值，再進(jìn)行線性回歸分析(圖3A)，發(fā)現(xiàn)回歸曲線與數(shù)據(jù)吻合很好，其回歸方程為：Y=0.2808eX/1.90124。

將細(xì)胞計(jì)數(shù)法結(jié)果作同樣處理后，進(jìn)行線性回歸(圖3B)，也呈現(xiàn)類(lèi)似的直線，僅相關(guān)系數(shù)和截距有些許差異，其回歸方程為：Y=-38299.5+38321.9eX/3666.2。

圖3 3種四爿藻葉綠素a平均含量和細(xì)胞數(shù)目變化曲線的回歸分析

由圖3可以看出，葉綠素a含量變化和細(xì)胞數(shù)目變化均呈規(guī)則的指數(shù)生長(zhǎng)曲線，這表明在大規(guī)模培養(yǎng)四爿藻時(shí)用葉綠素a含量變化間接反映細(xì)胞數(shù)目變化具備可行性。因?yàn)楹．a(chǎn)餌料生產(chǎn)中并不需要準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞數(shù)目，只需確定其最佳收獲四爿藻的時(shí)間而獲得最大收獲效率即可。因此，葉綠素a含量測(cè)定可以滿(mǎn)足這一需要。即用葉綠素a這一指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)四爿藻的四鞭毛運(yùn)動(dòng)期(生物量累積時(shí)期)的生長(zhǎng)狀況較為科學(xué)、可靠。

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定3種四爿藻的細(xì)胞數(shù)目、葉綠素a和葉綠素b的含量變化及幾種波長(zhǎng)下的特征光密度吸收值，分別繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明，葉綠素b含量變化和OD560、OD625、OD750變化與生長(zhǎng)趨勢(shì)不太吻合，而葉綠素a含量變化和細(xì)胞數(shù)目變化較為一致，呈現(xiàn)較為規(guī)則的指數(shù)生長(zhǎng)曲線。表明了利用葉綠素a含量變化可評(píng)價(jià)四爿藻生長(zhǎng)狀況。此外，葉綠素a含量測(cè)定方法較為直接，只需取少量細(xì)胞(1 mL 即可) 經(jīng)過(guò)乙醇簡(jiǎn)單抽提，再測(cè)定光密度值，方法簡(jiǎn)便、快捷，較適合大規(guī)模海產(chǎn)養(yǎng)殖的需求。

[1]Fabregas J，Dominguez A，Regueiro M，et al.Optimization of culture medium for the continuous cultivation of the microalgaHaematococcusplucialis[J].Appl Microbiol Biotechnol，2000，53(5)：530-535.

[2]羅立明，歐陽(yáng)葉新，胡鴻鈞.海洋單細(xì)胞四爿藻基因組DNA的微量提取[J].武漢植物學(xué)研究，2003，21(4)：295-300.

[3]山東海洋學(xué)院.海水養(yǎng)殖手冊(cè)[M].上海：上海科技出版社，1985:582-623.

[4]陳明耀.生物餌料培養(yǎng)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995：27-28.

[5]張成武，胡鴻鈞.朱氏扁藻作為中國(guó)對(duì)蝦幼體餌料的效果試驗(yàn)[J].海洋科學(xué)，1993，(5)：38-41.

[6]Lobban C S，Chapman D J，Kremer B P.Experimental Phycology.A Laboratory Manual[M].New York：Cambridge University Press,1988：16-93.

[7]沈萍萍，王朝暉，齊雨藻，等.光密度法測(cè)定微藻生物量[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版)，2001，22(3)：115-119.

[8]歐陽(yáng)葉新，羅立明，胡鴻鈞，等.我國(guó)沿海四爿藻的室內(nèi)培養(yǎng)[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，14(10)：1701-1704.