乙醇對簡單節桿菌TCCC 11037生長和細胞性質的影響

王建鋒，駱健美，宋 妍，劉 洋，鄭 宇，王 敏

(天津科技大學生物工程學院 工業微生物教育部重點實驗室 天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457)

甾體的C1，2位脫氫是糖皮質激素合成過程中的一個關鍵步驟。通常甾體脫氫衍生物在生理活性上要強于其前體，具有更好的抗炎和抗過敏活性，且副作用更小。自然界中許多微生物都具有C1，2位脫氫能力，其中簡單節桿菌(Arthrobactersimplex)以專一性高等優點成為研究和應用廣泛的菌株[1，2]。簡單節桿菌的轉化過程中需要加入有機溶劑以增加底物的溶解度，促進酶和底物的充分接觸，從而提高反應效率。目前，乙醇以其毒性低、污染小、成本低廉等優點在工業生產中廣泛使用[3]。

目前，簡單節桿菌C1，2位脫氫反應的研究多集中在有機溶劑的選擇[4]、工藝條件的優化[5]和脫氫動力學研究[6]。2009年，別松濤等[7]以菌體的糖代謝活力保留值表征多種有機溶劑對簡單節桿菌的毒性，該指標只是反映了細胞代謝活力的變化，而有機溶劑添加后對細胞性質的影響是非常復雜的[8]，需要從多方面進行考察。

作者從菌體生長、細胞形態、耗糖能力、跨膜電位和膜通透性等方面研究乙醇對簡單節桿菌TCCC 11037生長和細胞性質的影響，擬為深入了解有機溶劑對細胞生物學活性的影響提供基礎數據、也為毒性機理的研究奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑和儀器

簡單節桿菌(Arthrobactersimplex)TCCC 11037，天津科技大學生物工程學院微生物制藥研究室保存。

斜面培養基、種子培養基和菌體培養基參照文獻[9]配制。

無水乙醇、甲醇，天津市立元化工有限公司；羅丹明123(Rh123)、二乙酸熒光素(FDA)，德國默克公司；其它藥品均為市售分析純。

JSPM-5200型原子力顯微鏡；YJ-875S型醫用凈化臺；WS2-134-75型電熱恒溫培養箱；GB204型電子分析天平；Gilson微量取樣器； RF-5301PC型熒光分光光度計；SBA-90型生物傳感儀；UVmini-1240型紫外可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 斜面培養

30℃恒溫培養1～2 d。

1.2.2 種子培養

從斜面上挑取活化后的ArthrobactersimplexTCCC 11037菌種1環，接種于裝有30 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，160 r·min-1、32℃培養18 h，此時菌體OD600為0.8。

1.2.3 菌體培養

按5%的接種量將種子液接種于裝有30 mL菌體培養基的250 mL三角瓶中，160 r·min-1、32℃培養。菌體培養時根據需要添加不同體積分數的乙醇。

1.2.4 乙醇體積分數對菌體生長的影響

菌體培養基中分別加入體積分數為1%、2%、3%、4%、5%、6%的乙醇，接種后32℃、160 r·min-1培養32 h，每隔4 h取樣。通過平板活菌計數法確定添加不同體積分數乙醇后菌體的生長量，比生長速率的計算參照文獻[10]。其中，未添加乙醇的菌體培養基作為對照，每個實驗3個平行樣。

1.2.5 乙醇體積分數對細胞超顯微結構的影響

菌體培養基中分別加入體積分數為0%、2%、5%、8%的乙醇，接種后于32℃、160 r·min-1培養24 h。5000 r·min-1離心收集菌體，并用無菌水洗滌2次，將細胞于2.0%戊二醛溶液中固定，4℃冰箱內過夜。將細胞濃度調至相同(OD600為0.6)，取少量菌懸液于蓋玻片上，晾干，原子力顯微鏡檢測。成像在大氣環境下進行，掃描模式為輕敲模式，所有圖像均通過自動平滑和低通濾波處理以消除慢掃方向的低頻噪音，選擇5 μm視野進行觀察。

1.2.6 乙醇體積分數對菌體耗糖能力的影響

菌體培養基中分別加入體積分數為1%、2%、3%、4%、5%、6%的乙醇，接種后于32℃、160 r·min-1培養32 h，每隔約4 h取樣1 mL，稀釋20倍后用生物傳感儀測定發酵液中的殘糖濃度。其中，未添加乙醇的菌體培養基作為對照，每個實驗3個平行樣。

1.2.7 乙醇體積分數對菌體細胞膜跨膜電位和通透性的影響

菌體培養基中加入體積分數分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%的乙醇，接種后于32℃、160 r·min-1共同培養24 h，取10 mL培養液5000 r·min-1離心，生理鹽水洗滌2次后重懸，將菌體的OD600值均調至0.8(此時細胞濃度約為1×107cfu·mL-1)。細胞膜跨膜電位的測定采用Rh123熒光法[11]，膜通透性的測定采用FDA熒光法[11]。其中，未添加乙醇的菌體培養基作為對照，每個實驗3個平行樣。

2 結果與討論

2.1 乙醇體積分數對簡單節桿菌生長的影響(圖1、圖2)

圖1 不同乙醇體積分數下簡單節桿菌TCCC 11037的生長曲線

由圖1可知，在簡單節桿菌TCCC 11037生長過程中，乙醇的加入對菌體生長產生一定影響。隨著乙醇體積分數的增加，菌體生長的延滯期明顯延長。當乙醇體積分數達到6%時，24 h的生長量與培養初期基本上一致，即仍處于延滯期。另外，乙醇體積分數對菌體生長量有明顯的抑制作用，當乙醇體積分數為3%時，菌體量為1.9×109cfu·mL-1，僅為對照組的14.84%，之后繼續增大乙醇體積分數到6%，菌體幾乎未見明顯生長。

圖2 不同乙醇體積分數下簡單節桿菌TCCC 11037的比生長速率

由圖1和圖2可知，簡單節桿菌TCCC 11037的初始生長速率和比生長速率均隨著乙醇體積分數的增加而下降。當添加1%乙醇時，菌體的比生長速率為0.2662 h-1，添加3%乙醇時為0.1550 h-1，分別比對照組(0.3479 h-1)下降了23.49%和55.45%；繼續增大乙醇體積分數，菌體比生長速率繼續下降但變化不大，維持在0.0680～0.0419 h-1的較低水平，僅為對照組的19.54%～12.04%。

2.2 乙醇體積分數對簡單節桿菌超顯微結構的影響(圖3)

圖3 不同乙醇體積分數下簡單節桿菌TCCC 11037的超顯微結構

由圖3可知，在簡單節桿菌TCCC 11037生長過程中，隨著添加乙醇的體積分數逐步增大，簡單節桿菌TCCC 11037的細胞形態出現較明顯變化。對照菌體的細胞形狀較規則，近短桿形，細胞膜光滑完整；2%乙醇組的細胞出現不規則的形狀，兩端有向上翹起的趨勢，細胞長徑減小，部分有凹陷；5%乙醇組的細胞體積明顯增大，部分細胞膜出現破損，細胞表面較對照組粗糙；8%乙醇組的細胞形狀極不規則，細胞發生明顯的胞漿外泄，完整性受到明顯破壞。

2.3 乙醇體積分數對簡單節桿菌耗糖能力的影響(圖4)

圖4 不同乙醇體積分數下簡單節桿菌TCCC 11037的耗糖情況

由圖4可知，在簡單節桿菌TCCC 11037生長過程中，乙醇的加入對菌體的耗糖能力產生了一定的抑制作用，耗糖速率和耗糖量隨著添加的乙醇體積分數的增大均呈明顯下降趨勢。添加3%乙醇菌體生長到20 h和32 h時，培養液中的殘糖濃度分別下降了2.5 g·L-1和4.2 g·L-1，為對照組耗糖量的37.88%和55.26%。添加6%乙醇菌體生長到20 h時，菌體的耗糖量僅為0.3 g·L-1，延長培養至32 h，菌體的耗糖量仍維持在較低水平，僅為0.7 g·L-1，是對照組耗糖量的9.21%，說明添加6%乙醇時菌體耗糖能力幾乎完全受到抑制。

2.4 乙醇體積分數對簡單節桿菌跨膜電位和通透性的影響(圖5)

圖5 乙醇體積分數對簡單節桿菌TCCC 11037跨膜電位和通透性的影響

由圖5可知，在簡單節桿菌TCCC 11037生長過程中，菌體的跨膜電位隨著乙醇體積分數的增大表現出下降的趨勢，當乙醇體積分數為3%時，Rh123熒光強度為對照組的85.86%，當乙醇體積分數繼續增大到6%時，僅為對照組的75.42%。一般認為，菌體跨膜電位的下降說明細胞自身生命活力的減弱[12]。由圖3可知，這種細胞活力的減弱可能是因為高體積分數乙醇存在下細胞完整性受到破壞，胞漿大量外泄造成的。

細胞膜的通透性隨著乙醇體積分數的增大表現出增大的趨勢，當乙醇體積分數為3%時，FDA熒光強度為對照組的106.58%；當乙醇體積分數繼續增大到6%時，為對照組的118.37%。這說明隨著乙醇體積分數的增大，細胞膜的通透性增大，有機溶劑在細胞膜內積累濃度的增大是抑制菌體生長和細胞活力的重要原因[8]。

3 結論

(1)考察了乙醇體積分數對簡單節桿菌TCCC 11037生長的影響。結果發現，乙醇對菌體生長產生抑制作用。隨著乙醇體積分數由1%逐步遞增到6%，菌體延滯期相應不斷延長，菌體生物量和菌體的比生長速率呈逐步下降趨勢。當乙醇體積分數為3%時，簡單節桿菌TCCC 11037的延滯期延長到了16 h，生長量為對照組的14.84%，比生長速率下降為對照組的44.55%。當乙醇體積分數為6%時，幾乎觀察不到明顯的菌體生長。

(2)考察了乙醇體積分數對簡單節桿菌TCCC 11037細胞完整性的影響。原子力顯微鏡觀察發現，對照組的細胞形狀較規則，近短桿形，細胞膜光滑完整。實驗組菌體主要呈短桿狀和球狀，細胞形狀不規則，細胞表面不平整，菌體形態隨著乙醇體積分數的增大出現顯著改變，當乙醇體積分數為8%時，出現了明顯的細胞破損和胞漿外泄，細胞完整性明顯破壞。

(3)考察了乙醇體積分數對簡單節桿菌TCCC 11037的耗糖能力、跨膜電位和通透性的影響。結果發現，隨著乙醇體積分數的增大，菌體的耗糖能力受到抑制，菌體生長到32 h時，對照組和3%乙醇添加組中的葡萄糖濃度由9.8 g·L-1分別下降到2.2 g·L-1和5.6 g·L-1，在6%乙醇下，培養基中的葡萄糖幾乎沒有明顯消耗。利用Rh123法和FDA法分別考察了乙醇體積分數對菌體跨膜電位和通透性的影響，結果表明，隨著乙醇體積分數的增大，跨膜電位下降，細胞膜通透性增大。當乙醇體積分數為3%時，跨膜電位下降14.14%，細胞膜通透性增加6.58%；當乙醇體積分數為6%時，跨膜電位下降24.58%，細胞膜通透性增加18.37%。

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