分析精液蛋白激酶A與男性不育患者精液參數及精子形態的關系

陳鵬勛

（鄭州人民醫院 檢驗科，河南 鄭州 450000）

蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）普遍存在于真核細胞，介導跨膜信號的信號傳導，其作用于各種與糖脂代謝相關的酶類。PKA是精子蛋白酪氨酸磷酸化限速酶，參與精子運動力、精子超激活運動、精子獲能等多種生理生化過程。有研究表明PKA在調節精子活力方面起主要作用，可能影響精子形態，而精子活力和精子形態影響精子的功能從而直接關系到男性的生育能力。目前，有關精液PKA含量與男性不育患者精液主要參數及精子形態的相關性研究較少，且確切關系仍有爭議。本研究通過對比不同精子活力和精子形態男性不育患者精液PKA含量，來探討精液PKA含量與男性不育患者精液活力及精子形態的關系，以期為男性不育的臨床診斷和治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2010年2月－2011年6月我院診治的男性不育患者300例，年齡25～38歲，平均（31.3±3.2）歲，不育年限1～7年，平均（4.0±1.4）年。納入標準：夫婦雙方性生活正常，婚后未避孕1年以上未孕，女方檢查無明顯異常，男方無明顯睪丸、附睪及輸精管異常，無性功能障礙史，無外傷及家族遺傳性病史，無不良生活習慣（如煙酒等嗜好）；排除染色體檢查異常者。

1.2 方法

（1）精液采集與分析：禁欲3～7天，在實驗室手淫法留取全部精液，置于清潔干燥的取精杯中，37℃水浴待液化后進行精液常規分析，分析系統采用WLJY9000彩色精子質量檢測系統（北京偉力新世紀科技發展有限公司）。按第四版《WHO人類精液及精子－宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》精液參數檢測方法檢測。

（2）精液PKA含量的測定：取出酶標板，按序在空白微孔中加入50μL標準品。標記樣本后加50μL樣本至空白微孔中。在標準品孔和樣本孔中各加入50μL酶標記溶液，37℃孵育60min，洗板機清洗5次，靜置10～20s。每孔加入底物呈色劑A液和B液各50μL，37℃下避光孵育15min，后加入50μL終止液終止反應。在波長450nm的酶標儀上讀取各孔的吸光度值（A）。B＝標準品A值，BO＝標準品O點A值，以B／BO%值為縱坐標，以標準品的濃度為橫坐標，在對數坐標紙上繪制標準曲線（線性范圍1～100ng／mL）。在標準曲線上查找對應的濃度范圍。試劑盒敏感性為1.0ng／mL。

（3）改良巴氏染色：標本置于95%乙醇溶液固定5～15min，按WHO推薦的改良巴氏染色法染色、脫水、透明和封片，按Kruger等標準油鏡下每張涂片觀察200個以上精子（只觀察有尾部的可辨認完整精子），計錄正常和畸形精子。

（4）參數記錄和比較：記錄患者年齡、不育年限、精液量、液化時間、精子密度、精子活力、PKA含量。根據精子活力將患者分為活力正常組（a＋b級精子≥50%）、輕度弱精組（25%＜a＋b級精子＜50%）和重度弱精組（a＋b級精子＜25%）；另根據精液形態檢測結果，將患者分為形態正常組（正常形態精子≥14%）和形態異常組（正常形態精子＜14%）。比較各組相關參數差異。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 不同精子活力組相關參數比較

不同精子活力組相關參數比較見表1。與活力正常組相比，輕度弱精組和重度弱精組PKA含量明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。輕度弱精組PKA含量明顯降低重度弱精組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 不同精子活力組相關參數比較（）

表1 不同精子活力組相關參數比較（）

注：＊P＜0.05，與活力正常組比較；＃P＜0.05，與輕度弱精組比較。

活力正常組（n＝114）輕度弱精組（n＝98）重度弱精組（n＝88）30.7±2.7 31.2±3.0 32.2±3.4不育年限（年） 3.8±1.3 4.0±1.5 4.1±1.7精液量（mL） 2.5±0.79 2.4±0.81 2.4±0.78液化時間（min） 40.6±12.5 35.8±12.8 34.6±12.4密度（×106／mL） 76.6±21.6 68.2±23.9 67.6±13.9 PKA含量（ng／mL） 66.9±9.67 58.3±8.89＊ 45.1±8.67＊＃年齡（歲）

2.2 精子形態正常組和形態異常組相關參數比較

精子形態正常組和形態異常組相關參數比較見表2。與精子形態正常組相比，形態異常組的PKA含量顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 正常形態組和異常形態組相關參數比較（）

表2 正常形態組和異常形態組相關參數比較（）

注：＊P＜0.05，與正常組比較。

正常組（n＝147） 異常組（n＝153）30.7±5.7 31.9±5.3不育年限（年） 4.58±2.8 4.32±2.9精液量（mL） 2.7±0.77 2.5±0.71液化時間（min） 39.6±11.5 36.8±12.5 PKA含量（ng／mL） 65.6±8.63 47.2±7.98＊年齡（歲）

3 討論

3.1 PKA的作用基礎

PKA又稱為依賴于cAMP的蛋白激酶A，活化的PKA可作用于各種與糖脂代謝相關的酶類，一些離子通道和某些轉錄因子，使它們發生磷酸化并改變其狀態。而精子蛋白酪氨酸磷酸化是精子運動力、精子超激活運動、精子獲能等多種生理生化過程的重要調控因素。表明PKA在調節精子活力方面起主要作用。

另有研究表明AKAP為調節精子運動力的支架蛋白，在獲能過程中AKAP3發生酪氨酸磷酸化將增加與PKA結合的蛋白，使得PKA在特異細胞結構中被募集與激活，最終提高精子運動力。

3.2 PKA含量與精子活力之間的關系

關于PKA含量與精子活力之間的研究比較多，認為PKA含量可以直接影響精子活力。本文也得出了一致的結論，與活力正常組相比，輕度弱精組和重度弱精組PKA含量明顯降低，差異具有統計學意義。分析原因可能是通過調節精子尾部動力蛋白表面的亞基磷酸化或通過cAMP／PKA途徑調整精子活力。

3.3 PKA含量與精子形態之間的關系

精子形態分析一直是男性不育研究的熱點，因為精子形態直接關系精子的功能和受精能力。關于PKA的研究一直較多集中在PKA的作用機理以及它對精子活力的影響，較少見到PKA在精子形態方面的研究。本文比較不同精子形態下的PKA含量發現，與精子形態正常組相比，形態異常組的PKA含量顯著降低，差異有統計學意義。提示PKA與精子形態關系密切，可能通過某種途徑影響精子的發育和成熟，說明PKA不僅影響精子活力，也可以影響精子形態。關于其深層次的機制問題尚需進一步的研究。

綜上所述，PKA含量與精子活力關系密切，并影響精子形態，其確切的分子機制仍需進一步研究。

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