地榆微波滅菌的研究探討

王彩英

（溧陽市人民醫院，江蘇 溧陽 213300）

本品為薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或長葉地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia（Bert）Yu et Li的干燥根，前者主產南北各地，后者習稱“綿地榆”［1］，主產于安徽、浙江、江蘇、江西等地。始載于《神農本草經》，被列為中品。其性微寒，味苦、酸、澀，歸肝、大腸經，具有涼血止血、解毒斂瘡的功效，用于便血痔血、水火燙傷、血痢崩漏、癰腫瘡毒等癥。地榆根中含有多種苷類及酚酸類化合物，而鞣質為地榆止血的主要成分。近年來，有關地榆皂苷及黃酮類成分的研究漸多，亦發現了一些新的藥理作用，如抗氧化、抗癌、增強免疫等，這些都有助于開辟地榆的臨床新用途。地榆在試管內對金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌以及白喉、痢疾、大腸、傷寒、副傷寒、綠膿、人型結核等桿菌都有抑制作用，對某些致病真菌也有不同程度的抑制作用［2］。本文旨在通過薄膜過濾法［3］，消除地榆抗菌成分對微波滅菌效果的結果觀察，結合姚遠［4］、應月青［5］、梁霞［6］等人的文獻綜述，論證微波滅菌對于醫院制劑原材料滅菌的可行性，并通過多次實驗尋求最佳滅菌效果所需要的各項條件。

1 試藥與樣品

1.1 藥材

地榆：購于溧陽市醫藥公司，產品批號：2010080，安徽海鑫中藥飲片有限公司出品。

1.2 儀器

微波滅菌機：WG－5，5000W （山東省青州市精誠醫藥裝備制造有限公司）；300g搖擺式高速萬能粉粹機：DFY－300，1000W（溫嶺市林大機械有限公司）；馬頭牌JYT－5架盤藥物天平（上海光正醫療儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱：G2X－DH·400－BS－Ⅱ，800W （上海躍進醫療器械廠）；電熱恒溫培養箱：HH·BII·420－BY－Ⅱ，400W （上海躍進醫療器械廠）；霉菌培養箱：MJ－160B－Ⅱ，200W（上海躍進醫療器械廠）；立式滅菌機：LMQ·C51L，1200W（山東新華器械醫療股份有限公司）；菌落計數器：XK97－A（姜堰市新康醫療器械有限公司）。

1.3 試液、稀釋劑以及培養基

pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液；營養瓊脂培養基；玫瑰紅鈉瓊脂培養基；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基；膽鹽乳糖增菌液；膽鹽乳糖發酵培養基；MUG培養基；營養肉湯培養基；改良馬丁培養基；改良馬丁瓊脂斜面培養基。

1.5 實驗用菌株

大腸埃希菌 （Escherichia coli）：［CMCC（B）44102］；金黃色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）：［CMCC（B）26003］；枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis）：［CMCC（B）63501］；白色念珠菌（Candida albicans）：［CMCC（F）98001］；黑曲霉（Aspergillus niger）：［CMCC（F）98003］。

2 實驗方法

2.1 微波滅菌

在無菌條件下，取地榆飲片6份，3份用純化水噴淋至微濕，另3份不經噴淋直接置于干燥板上滅菌，在同樣的環境下微波滅菌，做三組平行試驗。取地榆飲片2份，一份打粉后置于微波滅菌機中滅菌10min，一份原片置于微波滅菌機中滅菌12min。分別多點取樣，留用觀察。在無菌環境下，先用純化水將所需實驗用地榆飲片淋濕，使其達到一定含水量，以保證最佳滅菌效果［7］。將噴淋的地榆飲片均勻鋪于微波滅菌板上，厚度約0.5cm。調節微波滅菌機滅菌波段，我們選擇PP01機組，使用微波滅菌機總功率的1／3，滅菌溫度控制在75℃～85℃，分別滅菌7、8、9、10、11、12、13、14、15、16min。

2.2 供試品制備

將滅菌后的地榆飲片置于300g搖擺式高速萬能粉粹機中粉碎成細粉。取樣品適量，放于無菌一次性培養皿中備用。

2.3 無菌檢查方法驗證

2.3.1 試驗菌種及菌液制備

取各菌濃培養液，按1mL→9mL pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液的10倍稀釋法，制成含菌50～100cfu／mL的供試菌液。

2.3.2 薄膜過濾法驗證

①試驗組：將規定量的地榆供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾，取出濾膜接種至改良馬丁培養基中；②對照組：另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。按規定培養3～5d，各試驗菌同法操作。

結果判斷：使用薄膜過濾法的供試品容器中的試驗菌生長良好，則供試品地榆粉末的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。故宜采用薄膜過濾法檢查微生物限度。

2.3.3 菌落計數的驗證

①試驗組：薄膜過濾法計數：取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，取出濾膜，菌面朝上貼在營養瓊脂培養基或者玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基平板上置相應的溫度培養相應的時間。②菌液組：分別測定所加的試驗菌數，菌—＞平皿；③供試品對照組：取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品的細菌、霉菌和酵母菌數（即供試品的本底菌數）；④稀釋劑對照組：用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1mL供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。

回收率計算：①試驗組：（試驗組－供試品組）／菌液組×100%

②稀釋劑組：稀釋劑組／菌液組×100%

表1 薄膜過濾法菌回收率

結果判斷：在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率和試驗組的菌回收率均不低于70%，說明薄膜過濾法計數可行。

2.3.4 控制菌檢查方法驗證

程序：（預增菌培養）增菌培養→分離培養→純培養→革蘭染色鏡檢、生化反應。①試驗組：取規定量供試液及10～100cfu試驗菌加入增菌培養基中，依相應控制菌檢查法進行檢查。當采用薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養基或取出濾膜接入增菌培養基中；②陰性菌對照組：供試液＋陰性菌，同試驗組——驗證該控制菌檢查方法的專屬性［10］；③陰性對照菌株：金黃色葡萄球菌——驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌；大腸埃希菌——驗證金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、梭菌檢查。

2.4 微生物限度檢查法

2.4.1 實驗用培養基以及器材消毒滅菌

將配制好的pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖增菌液、膽鹽乳糖發酵培養基、PYD培養基、MUG培養基分別放于相應錐形瓶或試管中，瓶口或管口用滅菌塞子塞好，并用布扎好，于立式滅菌機中121℃消毒滅菌1h。玻璃培養皿罐裝于帶蓋不銹鋼桶，置于恒溫干燥箱中160℃滅菌120min。

2.4.2 供試品溶液配制

精密稱取滅菌后的地榆10g至200mL錐形瓶，加pH 7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，配成1：10供試液。

2.4.3 細菌、霉菌和酵母菌計數

（1）10倍遞增稀釋試驗組。用一次性無菌注射器吸取1：10供試液1mL，均勻經濾膜濾過，再用不少于100mL pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液溶液沖洗濾膜，用鑷子將濾膜取出，菌面朝上貼于無菌雙碟底部。另取1mL供試液，注入9mLpH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液，配成1：100稀釋級供試液，同法制備四個碟子。再取1：100稀釋級供試液1mL配成1：1000稀釋級，同法再制備四個碟子。每一稀釋級每種培養基至少注2個平皿。

（2）陰性對照。待各級稀釋液注皿完畢后，用1支1mL針管吸取稀釋劑（pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液）各1mL，分別注入四個平皿中。其中兩個作細菌陰性對照，兩個作霉菌、酵母菌數陰性對照。另外準備兩個無菌空平皿作培養基空白。

（3）傾注培養基。將預先配制好的細菌計數用的營養瓊脂培養基；霉菌、酵母菌計數用的玫瑰紅鈉瓊脂培養基和YPD瓊脂培養基熔化，冷卻至約45℃時，傾注上述各個平皿約15mL，以順時針或逆時針方向快速旋轉平皿，使供試液或稀釋液與培養基混勻，蓋上陶瓦蓋，置操作平臺上待凝。

（4）培養。細菌計數平板倒置于32℃電熱恒溫培養箱中培養48h。霉菌、酵母菌計數平板倒置于25℃、相對濕度75%霉菌培養箱中培養72h。

（5）菌落計數。將培養好的平皿放置于菌落計數器上或從平板背面直接以肉眼點計，以透射光襯以暗色背景，仔細觀察。盡量不漏計細小的瓊脂層內及平皿邊緣生長的菌落。并注意與地榆供試品粉末顆粒、培養基沉淀物、氣泡的鑒別。必要時，用放大鏡或低倍顯微鏡直接觀察。菌落極小不易辨認的延長培養時間到5d。

2.4.4 控制菌檢查——大腸埃希菌

（1）薄膜過濾法。用一次性無菌注射器吸取供試液10mL，注入稀釋劑100mL中，搖勻，以無菌操作加入裝有直徑45mm，孔徑0.45μm微孔濾膜的薄膜過濾器中，過濾，用稀釋劑沖洗濾膜，不少于100mL，用鑷子取出濾膜，加入預先配制好的100mL膽鹽乳糖增菌液培養基中。另一份100mL膽鹽乳糖（BL）培養基中加入等量稀釋劑作陰性對照。培養18～24h，必要時延長到48h。取上述培養物0.2mL，接種至含5mLMUG培養基的試管內，培養，于5、24h在366nm紫外光下觀察，同時用未接種的MUG培養基作本底對照。觀察后，沿培養基的管壁加入數滴靛基質試液。液面呈玫瑰紅色，為靛基質陽性；呈試劑本色，為靛基質陰性。本底對照的MUG和靛基質應為陰性。如MUG陽性，靛基質陽性，判斷檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。如呈現MUG陽性、靛基質陰性或MUG陰性、靛基質陽性時，應將上述供試品BL增菌培養液輕輕搖動，以接種環沾取1～2環培養液劃線于EMB或麥康凱瓊脂培養基平板上，培養18～24h。若平板上無菌落生長、或生長菌落與菌落形態特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。

（2）結果及結論。在紫外光下管內培養物不呈現熒光，MUG陰性。加入靛基質試液后，液面呈試劑本色，為靛基質陰性。判斷地榆粉末供試品中未檢出大腸埃希菌［8］。

2.4.5 大腸菌群

（1）增菌培養。取不少于10mL膽鹽乳糖發酵培養基管3支，加入1：10供試液1mL（含供試品0.1g）；1：100稀釋的供試液1mL（含供試品0.01g）和1：1000稀釋的供試液1mL（含供試品0.001g）。取2支膽鹽乳糖發酵培養基10mL管，一支加入稀釋劑1mL作為陰性對照，一支不加作為培養基空白對照。均培養18～24h，觀察結果。加供試液的膽鹽乳糖發酵培養基管中無菌生長或有菌生長但不產酸產氣，則判斷該管未檢出大腸菌群，若膽鹽乳糖發酵管產酸產氣，應進一步分離培養。

（2）分離培養。將上述產酸產氣的發酵管中的培養物，分別劃線接種于曙紅亞甲蘭瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基的平板上，培養18～24h。若平板上無菌落生長，或生長的菌落與特征不符或為非格蘭陰性無芽孢桿菌，判斷未檢出大腸菌群；若平板上生長有菌落形態特征菌或者疑似菌落，且為格蘭陰性芽孢桿菌，應進行確證實驗。

（3）確證實驗。從上述分離平板上挑出4～5個疑似菌落，接種于乳糖發酵管中，培養24～48h。若產酸產氣，判斷膽鹽乳糖發酵管中檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。

表2 地榆飲片干片與濕片微波滅菌效果比較

表3 不同工藝程序對滅菌效果的影響

表4 微波滅菌不同時間效果

3 結果與討論

在實驗過程中，不斷摸索最佳滅菌條件，經過多次重復試驗，發現地榆的滅菌溫度控制在75℃～85℃是比較合適的，在此溫度下，比較容易控制時間，不會因為升溫過快導致地榆炭化等問題促使試驗失敗。我們采用頻率2450MHz，功率0～3kW 的連續高功率微波［12］，對干濕狀態的細菌進行不同強度及時間的輻照，比較其殺滅率。實驗顯示：不同強度及輻照時間的微波對干菌作用后，其溫度無顯著變化，但活菌數顯著減少；對濕菌的殺滅效果顯著高于干菌。已有文獻資料顯示含水量對殺菌效果影響較大，當含濕率≤25%時，含濕率越高，殺菌效果越好［11］。所以以后醫院在制劑原材料滅菌方面，我們推薦用純化水將藥材噴淋后滅菌打粉入藥。

對于先滅菌還是先打粉的問題，通過實驗，我們發現先打粉后滅菌的地榆飲片的滅菌效果雖然不錯，但差異很大，且滅菌溫度不易控制，在滅菌12min后，粉狀地榆多處出現炭化現象。故建議醫院制劑進行原藥材滅菌時，采取先滅菌后打粉的方法。地榆的微波滅菌，隨著滅菌時間的增長，滅菌效果變化較大，滅菌7min，微生物檢查不合格，8min接近合格，在15min達到最佳滅菌效果，到達16min后，地榆飲片在微波滅菌過程中局部出現炭化現象。因此，地榆的最佳滅菌時間段為9～16min。

微波是實現安全、可靠、高效滅菌的一種方法，只要時間和溫度控制得當，就能達到很好的滅菌效果。但微波對不同藥材和菌種的滅菌，還需通過實驗摸索具體的滅菌條件，對特殊的使用條件須設計相應的微波設備，對微波滅菌機理的解釋仍存在很多疑問，這將是該領域今后研發的一個重點。

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