蜂膠對幽門螺桿菌的體外抑制作用

陸少燕，宗素進，杜苗苗，林 剛，杜季梅

（溫州醫學院 檢驗醫學院，浙江 溫州 325027）

幽門螺桿菌（Helicobactor pylori，Hp）是人類常見的致病菌，是慢性胃炎、消化性潰瘍等多種消化道疾病的重要致病因素之一，與胃癌的發生密切相關，1994年國際癌癥組織將其確定為I類致癌原。

蜂膠（propolis）是蜜蜂從植物幼芽與樹干上采集的樹膠與其上顎腺分泌物和蜂蠟等混合加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。蜂膠成分復雜，已知成分包括多酚類（黃酮、酚酸及其酯類）、萜類、甾類、氨基酸及揮發性物質，不僅在抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥和免疫調節等方面具有重要的生物活性［1］。中醫藥文獻記載，蜂膠具有潤膚生肌、解毒殺菌、祛風止痛之功效，在民間有服用蜂膠酒治療胃病的習慣。國內外研究證明，蜂膠不僅對多種細菌、真菌、病毒等有抑制和殺滅作用，還具有抗氧化、增強巨噬細胞吞噬、促進腫瘤細胞凋亡等作用［2］。

根據前期試驗結果，作者選擇黑龍江純蜂膠，用95%乙醇溶解后，對Hp進行體外抑菌實驗，結果報道如下。

1 材料

1.1 原料與試劑

菌株：NCTC11637，由浙江大學嚴杰教授饋贈；培養基：哥倫比亞培養基（CMO331），10%脫纖維綿羊血 （購自杭州新銳生物工程有限公司）；純蜂膠：購于黑龍江省牡丹江市小蜜蜂生物工程有限責任公司；溶劑：乙醇，分析純；其他：無菌蒸餾水、6號新華濾紙、游標卡尺等。

1.2 儀器與設備

手提式不銹鋼蒸汽滅菌器，艾奇小厭氧罐，電熱恒溫培養箱，雙人單面凈化工作臺。

2 方法

2.1 蜂膠紙片制備

稱取純蜂膠100g，磨碎后溶于200mL95%乙醇中（稀釋度為1∶2），連續2倍倍比稀釋至1∶1024，得到不同濃度的蜂膠溶液。用打孔器將6號新華濾紙打成直徑為6mm的圓形紙片，121℃高壓蒸汽滅菌15～20min，烘干備用。每張濾紙片加不同濃度蜂膠溶液7μL，以95%乙醇作空白對照。37℃放置1h，制成含量不同的藥敏紙片，4℃避光保存備用。

2.2 H.pylori固體培養基的配制

稱取哥倫比亞瓊脂干粉19.5g，加入蒸餾水450mL，用121℃高壓蒸汽滅菌15～20min，待冷卻到50℃，加50mL脫纖維綿羊血，配成含10%纖維綿羊血的哥倫比亞培養基，傾倒于無菌培養皿。

2.3 菌液的制備

將H.pylori于厭氧罐中在37℃孵箱內培養3天，用布氏肉湯將其洗脫配制成懸液，通過酶標儀檢測幽門螺桿菌濃度，將其制備為108CFU／mL的布氏肉湯菌液。

2.4 抑菌試驗

將108CFU／mL的布氏肉湯菌液接種到哥倫比亞血平板后，用鑷子小心將不同濃度藥敏紙片貼于平板上。每個平板貼三片，呈正三角形，每個濃度紙片共重復4次。置厭氧培養罐中，37℃培養72h，游標卡尺測量抑菌圈直徑，記錄測量結果。

3 結果

不同濃度蜂膠紙片對幽門螺桿菌（H.pylori）的72h抑菌作用結果見表1。

4 討論

蜂膠含有黃酮類、酚類、內酯、醛、酮、甾類等化合物，同時為無毒、無刺激、無致癌性，并具有抗菌、抗病毒、免疫激、鎮痛、促進組織再生等作用，因此蜂膠享有“紫色黃金”美譽。咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester，CAPE）是蜂膠中的主要活性成分［3］，它作為抗氧化藥物和癌預防藥物研究的明星分子，受到了人們極大關注。CAPE對胃的保護通過阻止幽門螺桿菌及其誘發的細胞因子Kappa B蛋白降解，而且CAPE能夠抑制由幽門螺桿菌誘發的細胞增殖以及細胞因子TNF－alpha及IL－8的生成，另外CAPE還可以阻斷幽門螺桿菌誘發的COX－2的表達。經CAPE預處理的胃上皮細胞同樣能夠阻斷細胞因子和細胞分裂素誘發的 NF－kappaB和 AP－1的表達［4］。

表1 不同濃度蜂膠紙片對幽門螺桿菌（H.pylori）的72h抑菌作用結果（）

表1 不同濃度蜂膠紙片對幽門螺桿菌（H.pylori）的72h抑菌作用結果（）

稀釋度 蜂膠含量（μg／片） 抑菌圈直徑（mm）實驗序號 抑菌圈直徑（mm）1 2 3 41∶2 3500.0 31.10 33.10 31.40 33.00 32.15±0.911∶4 1750.0 32.88 30.00 30.40 29.80 30.77±1.241∶8 875.0 29.10 27.60 30.20 28.20 28.78±0.981∶16 219.00 27.60 24.40 29.20 32.80 28.50±3.021∶32 437.50 28.88 25.20 29.04 27.80 27.73±1.541∶64 109.50 25.80 23.20 24.96 23.08 24.26±1.161∶128 54.80 21.80 20.30 23.96 23.4 22.36±1.431∶256 27.40 20.40 24.00 20.80 22.2 21.85±1.411∶512 13.70 16.30 22.80 18.40 18.32 18.96±2.371∶1024 6.80 15.00 14.00 17.00 16.6 15.65±1.21

目前為止，關于蜂膠的臨床研究報道不多，Boyanova L等認為保加利亞蜂膠有很強的劑量依賴的抑菌活性［5］。Boyanova L等認為利用干燥的蜂膠紙片得到的保加利亞蜂膠具有重要的抗幽門螺桿菌的活性，也能夠抑制大腸彎曲菌以及空場彎曲菌的生長，蜂膠在幽門螺桿菌感染的預防與治療方面具有巨大的潛力［6］。

本試驗結果表明，95%乙醇溶解的黑龍江純蜂膠在不同濃度下對幽門螺桿具有較好的抑制作用，抑菌作用隨濃度降低而變小，從含量看明顯較陳煉等［7］報導的江西蜂膠效果好。與常用抗菌藥物相比，含6.80μg／片的蜂膠紙片抑菌圈直徑可達15.65mm，這與克拉霉素（15μg／片，＞17mm敏感，14～17mm中度敏感，＜14mm耐藥），呋喃唑酮（300μg／片，＞16mm 敏感，15～16mm 中度敏感，＜15mm耐藥），以及羥氨芐青霉素（40μg／片＞16mm 敏感，14～16mm中度敏感，＜14mm耐藥）相當［8］。鑒于蜂膠不僅具有抗幽門螺桿菌的作用，還具有促進組織愈合和抑制細胞增殖等作用，在抗生素類藥物的耐藥性問題日益突出的情況下，蜂膠作為一個多效的天然藥物，在幽門螺桿菌感染相關疾病治療方面可能具有廣闊的應用前景。

［1］符軍放，曹煒，索志榮，等.高效液相色譜法識別蜂膠特征組分及定量對比［J］.西北大學學報：自然科學版，2006，36（4）：587－591.

［2］MOK RYEON AHN，SH I GENORI KUMAZAWA，YUM I KO USU I，et al.Antioxidant activity and const ituents of propolis collected in variou areas of China［J］.Food Che mistry.，2007，101（4）：1383－1392.

［3］QIAN YIPING，WANG QI，CAO XIAOYAN.Structure－Activity Relationship for Anti－Haemolysis and Cytotoxicity A－gainst HL－60Cells of Caffeic Acid Phenethyl Ester Derivatives［J］.ACTA BIOPHYS ICA S INICA，2010，26（4）：294－300.

［4］ABDEL－LATIF MM，WINDLE HJ，HOMASANY BS，et al.Caffeic acid phenethyl ester modulates Helicobacter pylori－induced nuclear factor－kappa B and activator protein－1expression in gastric epithelial cells［J］.Br J Pharmacol.，2005，146（8）：1139－1147.

［5］BOYANOVA L，GERGOVA G，NIKOLOV R，et al.Activity of Bulgarian propolis against 94Helicobacter pylori strains in vitro by agar－well diffusion，agar dilution and disc diffusion methods［J］.J Med Microbiol.，2005，54（5）：481－483.

［6］BOYANOVA L，DEREJIAN S，KOUMANOVA R，et al.Inhibition of Helicobacter pylori growth in vitro by Bulgarian propolis：preliminary report［J］.J Med Microbiol.，2003，52（5）：417－419.

［7］陳煉，廖旺娣，李國華，等.江西蜂膠對幽門螺桿菌的體外抑菌作用研究［J］.江西醫學院院報，2009，12（49）：27－28，32.

［8］中國藥品生物制品檢定所.抗菌藥物藥敏試驗判斷標準［S］.1991：1.