揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞體外毒性的實(shí)驗(yàn)研究

張煥珠，宋偉民

（上海市黃浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 200126）

揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）是指在常溫下，沸點(diǎn)50℃～260℃的各種有機(jī)化合物。VOCs按其化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以進(jìn)一步分為烷類、芳烴類、酯類、醛類和其他等。目前已鑒定出的有300多種，最常見(jiàn)的有苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷、二異氰酸酯（TDI）、二異氰甲苯酯等。VOCs是造成室內(nèi)空氣污染的主要原因之一。揮發(fā)性有機(jī)物為親脂性化合物，腦組織是其主要靶器官之一，而且中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)外界危害因素極為敏感，當(dāng)受到侵襲時(shí)常首先受累。星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用不僅僅是支持和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元，還參與神經(jīng)元發(fā)育至神經(jīng)損傷的各種復(fù)雜過(guò)程。星形細(xì)胞培養(yǎng)具有細(xì)胞單一、觀察直接等優(yōu)點(diǎn)，已成為篩選神經(jīng)毒物，探索毒作用機(jī)制的重要方法［1－2］。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和器材

高糖型DMEM 培養(yǎng)基（Gibco公司），多聚－L－賴氨酸、胎牛血清（Hyclone公司），L－谷胺酰氨（上海伯奧生物科技有限公司），胰蛋白酶（上海華美生物有限公司），青霉素、鏈霉素（華北制藥股份有限公司）、MTT，酶標(biāo)儀，Beckman液體閃爍測(cè)定儀，超凈工作臺(tái)。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Napco，法國(guó)），倒置顯微鏡（Leica，德國(guó)），UnicoTM2000型分光光度計(jì)，6孔、24孔、96孔培養(yǎng)板（Costar）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD新生大鼠（1～3天齡），由上海醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供。

1.2 分離培養(yǎng)方法

選取出生2d內(nèi)的正常SD仔鼠，頸動(dòng)脈放血，取腦，將皮層組織移入D－Hank＇s液中，用吸管輕輕吹打，放置5min，取上清，進(jìn)行離心（5min，1500轉(zhuǎn)／min）。棄上清，加入DMEM營(yíng)養(yǎng)液（每升含6g葡萄糖，4mmol L－谷胺酰氨，10mM HEPES，1×105U青霉素，100mg鏈霉素，150mL胎牛血清），調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／mL，接種于培養(yǎng)瓶中，將此濃度細(xì)胞懸液接種于預(yù)先鋪好多聚－L－賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，以后每周換液2～3次。

1.3 揮發(fā)性有機(jī)化合物儲(chǔ)備液處理

將分析純?cè)噭┍?、甲醛、乙苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯配制成混合物（甲?4.1%、乙苯19.5%、二甲苯31.7%、苯7.3%、苯乙烯7.4%、甲醛9.3%），調(diào)節(jié)溶液pH 值為6.0，0.25μm濾膜濾過(guò)除菌。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

MTT［32（4，52二甲基噻唑）22，52二甲基四唑溴鹽］（Sigma）首先用 HBSS配制成5g／L的儲(chǔ)備液，0.25μm 濾膜濾過(guò)除菌，4℃避光可保存7天，使用前稀釋至所需工作液濃度。細(xì)胞培養(yǎng)3d，加入含不同揮發(fā)性有機(jī)物濃度的溶液，使終濃度為低濃度組（VOCs 3mmol／L），中濃度組（VOCs 6mmol／L），高濃度組（VOCs 9mmol／L）培養(yǎng)3d，每孔加入MTT15μL（115g／L），37℃孵育4h，棄去上清，每孔加入DMSO 100μL，室溫下放置10min，測(cè)定MTT光吸收值。按如下公式計(jì)算細(xì)胞活性：細(xì)胞活性（%）＝OD暴露－OD空白／OD對(duì)照－OD空白。

1.5 LDH實(shí)驗(yàn)

乳酸脫氫酶（LDH）釋放量的測(cè)定將純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞每毫升約1.3×106的細(xì)胞數(shù)，接種于24孔板中，培養(yǎng)3d后分組加入VOCs儲(chǔ)備液即對(duì)照組，使終濃度為對(duì)照組（VOCs 0mmol／L）、低 濃 度 組 （VOCs 3mmol／L）、中 濃 度 組 （VOCs 6mmol／L）、高濃度組（VOCs 9mmol／L）。培養(yǎng)72h后，吸取每孔板中的全部培養(yǎng)液，進(jìn)行LDH活性（U／L）測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

與揮發(fā)性有機(jī)物共同培養(yǎng)24h后，細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯異常，48h后細(xì)胞開(kāi)始失去正常的形態(tài)，變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形，細(xì)胞形態(tài)隨著染毒濃度增加改變加重，細(xì)胞也變得稀疏起來(lái)。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)

從圖1中可以看出，隨著染毒濃度的增加，細(xì)胞活性隨之下降，在6mM和9mM組下降水平與對(duì)照組比較，有顯著性差異，P值分別＜0.05和＜0.01。

圖1 VOCs暴露對(duì)細(xì)胞活性的影響

2.3 LDH實(shí)驗(yàn)

圖2顯示了VOCs對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞外乳酸脫氫酶的影響，可以看出，隨著染毒濃度的增加，細(xì)胞膜受損程度增加，細(xì)胞外乳酸脫氫酶含量增加，在9mm組達(dá)到顯著差異（P＜0.01）。

圖2 VOCs暴露對(duì)細(xì)胞外LDH含量的影響

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損害時(shí)，最早和最顯著細(xì)胞反應(yīng)之一［3］。這種反應(yīng)表現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（GFAP）的過(guò)度表達(dá)上。GFAP免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的增加不是由于星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，而是每個(gè)星形細(xì)胞GFAP表達(dá)的增強(qiáng)。關(guān)于揮發(fā)性有機(jī)物中甲苯的神經(jīng)系統(tǒng)毒性研究較多，在體外條件培養(yǎng)下，接觸甲苯的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，均表現(xiàn)了酶活性的改變。甲苯抑制神經(jīng)突觸體和星形膠質(zhì)細(xì)胞膜的Na＋，K＋－ATP酶和 Mg2＋－ATP酶活性，使膜脂流動(dòng)性增加［4］。Engelke等［5］將大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞突觸體暴露于甲苯，結(jié)果ATP酶活性呈線性下降，在最高濃度組（8mmol），ATP酶活性下降了近50%，乙酰膽鹼脂酶活性也呈下降趨勢(shì)。也有研究發(fā)現(xiàn)，星形細(xì)胞在體外接觸甲苯1h，Na＋，K＋－ATP酶活性輕度下降，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，而Mg2＋－ATP酶活性明顯低于對(duì)照組，呈劑量－效應(yīng)關(guān)系（P＜0.005）［6］。星形細(xì)胞是維持神經(jīng)元正常穩(wěn)態(tài)環(huán)境的細(xì)胞，細(xì)胞膜ATP酶起著重要作用。甲苯可通過(guò)酶的抑制作用而干擾星形細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)功能，并對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生毒作用。大鼠暴露于甲苯，可使海馬、小腦以及齒狀回反應(yīng)性的神經(jīng)膠質(zhì)增加，GFAP表達(dá)增加［7－8］，而在丘腦部位GFAP表達(dá)減少［9］。體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞急性暴露于甲苯，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞分裂素（絲裂原）活化蛋白激酶（MAPK）活性增加，可能是一種保護(hù)性反應(yīng)［10］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，暴露于揮發(fā)性有機(jī)物，可對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、形態(tài)造成一定損害，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)為多角形或不規(guī)則形，細(xì)胞較對(duì)照組稀疏，并隨濃度增加形態(tài)改變加重，從MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出暴露于VOCs，細(xì)胞活力下降。本次實(shí)驗(yàn)可以看到細(xì)胞外乳酸脫氫酶活力隨染毒濃度增加而升高，說(shuō)明VOCs可以使星形膠質(zhì)細(xì)胞膜完整性受損。

綜合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，VOCs可以對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞造成毒性損害，從而影響星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)支持作用以及神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致腦組織正常的結(jié)構(gòu)和功能改變，引起一系列神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀。

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