培養基不同血清比例對人胃癌SGC－7901細胞生長的影響

陳舒怡，姜學偉，趙 剛

（湖北中醫藥大學 基礎醫學院，湖北 武漢 430065）

SGC－7901細胞是20世紀80年代初由我國上海市第六人民醫院腫瘤研究組、復旦大學遺傳研究所、中國科學院上海藥物研究所和上海市腫瘤研究所等單位進行協作研究而培養建立的一株胃腺癌細胞株，腫瘤材料來自于一位56歲的女性胃腺癌患者。在培養過程中，SGC－7901細胞一直保持惡性上皮樣細胞的形態特點，如核質比較大，多數細胞為單核，核仁清晰［1］。

SGC－7901細胞株自建立以來在腫瘤學、藥理學和細胞生物學等研究領域獲得了廣泛應用，對于抗胃癌藥物的藥效評價與作用機理的揭示以及中草藥植物的抗癌有效成分篩選等方面的研究發揮了重要作用。

眾所周知，血清是細胞體外培養時在培養液中不可缺少的營養成分，能為細胞的生長提供必須的生長因子。目前國內的實驗室在培養SGC－7901細胞時，一般在培養液中加入10%左右比例的新生牛血清或小牛血清［2］。而目前市售國產新生牛血清的價格是每100mL百元人民幣以上，隨著養牛成本的逐年提高，牛血清的價格還會逐步提高。因此在細胞培養實驗中，血清是花費最多的常用試劑。在這種背景下，積極探索低血清細胞培養條件很有意義。我們根據腫瘤細胞能夠自行合成分泌生長因子，對外源血清依賴性較低的理論［3］，嘗試在培養SGC－7901細胞時，減少培養液中血清的比例。我們利用倒置顯微鏡和酶標儀觀察并檢測了該細胞在3%、6%和9%等血清比例的培養基中的生長狀態。

1 材料

1.1 腫瘤細胞株

人胃癌細胞株SGC－7901由武漢大學生命科學學院中國典型培養物保藏中心提供。

1.2 主要器材與儀器

低溫冰箱（MDF－192型，日本SANYO公司），CO2培養箱（HF240型，Heal Force公司），低速離心機（800型，常州國華電器有限公司），超凈臺（YJ－875型，上海博訊實業有限公司），倒置顯微鏡（CK40型，日本OLYMPUS公司），高壓滅菌器（常州國華電器有限公司），全自動酶標儀（Model 680型，BIO－RAD公司），微量移液器（10μL，200μL，1000μL，5mL上海大龍公司），T－25培養瓶（日本IWAKI公司），96孔培養板（日本IWAKI公司），塑料離心管 （15mL，美國Corning公司）。

1.3 主要試劑

RPMI 1640液體培養基（美國Hyclone公司），新生牛牛血清 （50mL裝，購自杭州四季青生物工程材料有限公司），青霉素與鏈霉素（粉劑，華北制藥公司），MTT（噻唑藍，上海試劑一廠），二甲基亞砜（DMSO，Fisher公司），胰酶細胞消化液 （100mL裝，碧云天公司）。

2 方法

2.1 配制不同血清濃度的培養基

在超凈工作臺中，分別配制含有3%、6%、9%血清和不含血清的RPMI－1640培養液（內含青霉素和鏈霉素各100U／mL），其中不含血清的培養基為空白對照。按分組在T－25型塑料培養瓶中分別加入相應血清含量的培養液，然后接種SGC－7901細胞。

2.2 細胞生長狀態的MTT法檢測

將人胃癌SGC7901細胞按2×103個細胞接種于96孔板內，每種濃度設3列共24個復孔，每孔體積200μL，37℃，5%CO2孵育，不同血清濃度的單列培養孔在12h、24h、48h后，先用倒置相差顯微鏡觀察不同血清濃度條件下細胞的形態與生長狀況，再向每孔加入 MTT溶液（5mg／mL）20μL，繼續培養2.5h。終止培養，小心吸去孔內培養液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min后，利用酶標儀，在選擇490nm波長下，測定各孔的光吸收值（OD值），記錄結果。

2.3 統計學方法

應用SPSS17.0統計分析軟件進行數據統計處理，數據以（）表示，多組間比較采用雙因素方差分析，兩組間比較采用SNK法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 不同濃度血清培養后細胞的生長狀態

倒置顯微鏡下可見，培養12h、24h、48h的細胞，3%、6%和9%等血清條件下，SGC－7901細胞的生長未見明顯差異。貼壁細胞生長良好，胞漿飽滿，形態舒展。而無血清對照組細胞生長狀態較差，細胞呈圓形，體積小，有部分脫落。（見圖2－圖5）

3.2 MTT法檢測細胞生長狀態

SGC－7901細胞在含有3%、6%和9%新生牛血清的培養液中培養12h、24h和48h后，用MTT方法檢測到的反映各組活細胞數量（即細胞生長狀況）的OD值見表1。統計分析結果顯示，不同時間組之間的檢測結果差異無顯著性（F＝0.005，P＝0.995），兩組間比較結果，各組之間的差異無顯著性（P＞0.05）。不同血清濃度組之間，兩組比較結果：對照組與各血清濃度組之間差異均有顯著性（P＜0.05），但3%、6%、9%血清濃度組之間差異無顯著性（P＞0.05）（見表1），各組OD值與時間之間的關系見圖1。

圖1 四種不同血清條件的細胞在3個培養時間的生長狀態（OD值）

表1 不同濃度血清培養液培養SGC－7901細胞不同時間的吸光度值（OD值）（）

表1 不同濃度血清培養液培養SGC－7901細胞不同時間的吸光度值（OD值）（）

注：與對照組相比，＊P＜0.05，血清各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

時間0.423±0.0300.329±0.0150.271±0.0443%血清 0.480±0.046＊ 0.508±0.027＊ 0.516±0.060＊6%血清 0.488±0.023＊ 0.525±0.041＊ 0.534±0.043＊9%血清 0.531±0.048＊ 0.572±0.058＊ 0.616±0.06112h 24h 48h對照組組別＊

4 討論

新生牛血清或小牛血清是體外培養各類細胞時需要在RPMI－1640等人工培養基中添加的重要天然成分［3］，能為細胞提供包括多種生長因子在內的低分子營養物，對于細胞的生長發育具有重要作用。本實驗結果也再次驗證了血清的作用。利用倒置顯微鏡觀察可見，在不含血清的對照組中，人胃癌SGC－7901細胞生長緩慢，形態呈圓形，體積小，出現部分脫落的現象。MTT法檢測結果顯示，對照組細胞的吸光度值（OD值）明顯低于其余三個使用含血清培養基實驗組的OD值。差異具有顯著性。說明在對照組的無血清條件下，SGC－7901細胞的生長與增殖活性較為低下。

然而，血清的成分復雜，不僅存在促進細胞生長發育分裂增殖的生長因子，同時也存在有細胞生長的抑制因子或毒性因子，有些成分至今未完全搞清楚。細胞在含血清培養基中所呈現出來的生物學特性是復雜血清因子作用的結果［5］；同時，牛血清的價格越來越高，不斷增加著細胞培養實驗的成本。因此，近20多年來，國內外多個實驗室在探索細胞的低血清培養甚至無血清培養技術和方法，取得了一些重要進展［6－7］。研究結果表明，有多種來自動物和人的正常細胞株以及腫瘤細胞株可以在低血清甚至無血清的培養基中正常地生長和增殖。當然，無血清培養基中一般需要另外加入多種生長因子、激素，才能維持細胞的正常生長［8］。

小牛血清含量為9%的PRMI－1640培養基是我們實驗室培養人胃癌SGC－7901細胞最常使用的細胞培養液，也用于人宮頸癌HeLa細胞、人肝癌SMMC－7721細胞和人結腸癌HCT－116細胞等多種腫瘤細胞株的培養。之所以選擇9%的血清比例是考慮到添加血清配制完全培養基時比較方便?，F在國內的細胞培養實驗室多使用500mL包裝的無菌液體培養基，在超凈工作臺內按無菌操作將100mL包裝的小牛血清直接傾倒1／2即50mL左右至裝有500mL液體培養基包裝瓶內，再加適量的雙抗溶液，蓋上瓶蓋，充分混合后即成9%血清的細胞培養基。這樣在培養基包裝瓶內直接添加血清，操作簡單快捷，不使用其它容器，減少了污染的機會。

本實驗結果表明，人胃癌SGC－7901細胞在血清含量為6%和3%的RPMI－1640培養基中的生長狀態與在9%血清含量培養基中的狀態差異無統計學意義。表明3%血清含量培養基中的包括生長因子和激素在內的各種營養物質，可滿足SGC－7901細胞的生長發育和分裂增殖的需要，在此條件下，癌細胞自身所合成和分泌的多種生長因子也發揮了一定的作用。根據本實驗結果，在培養人胃癌SGC－7901細胞時，可應用血清含量在3%～6%的低血清培養基，以減少小牛血清的用量，從而降低細胞培養的實驗成本，同時也可減少血清中有害成分的影響。

［1］劉玉琴，卞曉翠.實驗細胞資源目錄［M］.北京：人民軍醫出版社，2010：1－256.

［2］伍海鷹，陳一鳴，林龍，等.體外香菇多糖對順鉑抑制胃癌細胞增殖的促進作用［J］.世界華人消化雜志，2010，19（4）：244－248.

［3］GERALD KARP著.王喜忠等譯.分子細胞生物學［M］.北京：高等教育出版社，2005：658－659.

［4］弗雷謝尼著.章靜波等譯.動物細胞培養－基本技術指南［M］.北京：科學出版社，2004：468－479.

［5］李文鑫.無血清細胞培養研究［M］.武漢：湖北科學技術出版社，1993：1－8.

［6］劉鵬，金巖等，劉源，等.不同種數真皮成纖維細胞在不同濃度血清培養基中生長的比較觀察［J］.實用口腔醫學雜志，2004，20（1）：16－19.

［7］梅建國，莊金秋，沈志強.動物細胞無血清培養技術研究進展［J］.生物技術，2010，20（3）：87－89.

［8］楊學義，劉飛，向雙云，等.哺乳動物細胞無血清培養基研究進展［J］.動物醫學進展，2011，32（2），69－72.