迷迭香酸對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及機理探討

高麗萍，張文斌，景玉宏，鄭榮梁

（1.蘭州大學 基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.上海交通大學 藥學院，上海 200240；3.蘭州大學 生命科學學院，甘肅 蘭州 730000）

迷迭香酸是有一定生理活性的酚酸類化合物，為丹參素與咖啡酸的縮合物。迷迭香酸是許多唇形科植物如迷迭香、羅勒、檸檬香蜂草和留蘭香的主要成分。其分子結構中有四個酚羥基，具有多種生物活性，包括抗氧化［1］，抗過敏［2］、抗炎和抗病毒作用［3］，對肝損傷和肺損傷也具有保護作用［4，5］。我們研究發現迷迭香酸可以抑制H2O2誘導的星形膠質細胞的凋亡［6］，Iuvone等［7］研究表明迷迭香酸可以保護PC12細胞免受β－淀粉樣蛋白誘導的神經毒性作用，這些研究表明迷迭香酸對神經系統有一定保護作用。因此，我們利用線栓法制作了腦缺血／再灌注動物模型，研究迷迭香酸對大鼠腦缺血／再灌注損傷的保護作用及其機理。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物與試劑

迷迭香酸購自Sigma公司。2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）為中國醫藥上海化學試劑公司產品。SOD、GSH－Px和MDA試劑盒為南京建成生物工程研究所產品。

1.2 動物

雄性Wistar大鼠，體重200～280g，由蘭州大學醫學實驗動物中心提供。

1.3 儀器

病理圖象分析系統（四川大學產品），UV29100紫外可見分光光度儀（北京第二光學儀器廠產品）。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥

大鼠35只隨機分為5組，腹腔注射給藥3天后用線栓法造模［8］，缺血4h后再灌注2h，然后觀察各項指標。

1.4.2 行為學評分［9］

評分標準：①提鼠尾，左前肢內收，左肩內旋者1～4分。②將大鼠置光滑平面，推右肩向左側移動，阻力降低者1～3分。③左前肢肌張力降低1～3分。共10分。分數越高，動物的行為障礙越顯著。

1.4.3 腦梗塞體積的測定

大鼠股動脈取血然后迅速斷頭處死，連續冠狀切片，迅速放入2%TTC溶液（37℃）中染色30min，缺血區呈蒼白色，正常區為玫瑰色，采用病理圖象分析系統計算腦梗塞體積所占百分比。

1.4.4 MDA含量測定

大鼠股動脈取血制備血清，測定血清MDA含量。

1.4.5 SOD和 GSH－Px的活力測定

采用SOD和GSH－Px試劑盒測定血清SOD和GSHPx的活力。

1.4.6 統計學處理

2 結果

2.1 迷迭香酸對大鼠行為學的影響

除假手術組未出現神經缺損的癥狀外，其余各組出現不同程度的神經缺損的癥狀。表現為左前肢內收；軀體向病灶對側傾斜，向左側推阻力下降；部分大鼠活動時有向癱瘓側打轉現象。與假手術組比較，模型組出現嚴重的神經缺損癥狀。與模型組比較，迷迭香酸10、50mg／kg及葛根素50mg／kg均能顯著改善大鼠神經缺損的癥狀（P＜0.01）。在劑量相同時，迷迭香酸的作用與葛根素相當（P＞0.05）。結果見表1。

表1 迷迭香酸對腦缺血再灌注大鼠行為學和腦梗塞體積的影響（n＝7，）

表1 迷迭香酸對腦缺血再灌注大鼠行為學和腦梗塞體積的影響（n＝7，）

注：與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量（mg／kg） 行為學評分 腦梗塞體積（%）假手術對照組 —— 0＊＊ 0＊＊模型組 —— 7.14±0.83 22.92±1.92葛根素 50 5.5±0.5＊＊ 17.77±3.90＊迷迭香酸 10 4.86±0.64＊＊ 18.78±2.43＊＊迷迭香酸 50 4.57±0.73＊＊ 17.74±3.50＊＊

2.2 迷迭香酸對大鼠腦梗塞體積的影響

與假手術組比較，模型組出現嚴重的腦梗塞，腦梗塞體積為（22.92±1.92）%。與模型組比較，迷迭香酸10和50mg／kg對腦梗塞體積均有顯著的降低作用，分別使梗塞體積降低到（18.78±2.43）%和（17.77±3.90）%。在劑量相同時，迷迭香酸的作用與葛根素相當（P＞0.05）。結果見表1。

2.3 迷迭香酸對大鼠血清MDA含量的影響

模型組與假手術組比較，血清MDA含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，葛根素50mg／kg使 MDA含量降低39.69%，迷迭香酸10和50mg／kg分別使MDA含量減低42.05%和45.52%（P＜0.01）。結果見表2。

表2 迷迭香酸對腦缺血再灌注大鼠血清MDA含量、SOD和GSH－Px活力的影響（n＝7，）

表2 迷迭香酸對腦缺血再灌注大鼠血清MDA含量、SOD和GSH－Px活力的影響（n＝7，）

注：與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量（mg／kg）MDA（nmol／mL）SOD（NU／mL）GSH－Px（活力單位）假手術對照組—— 6.24±1.24＊＊ 157.03±8.26＊393.86±12.87＊＊模型組 —— 14.41±2.77141.02±14.34358.79±17.95葛根素 508.69±1.59＊＊ 164.04±5.76＊＊385.37±9.56＊＊迷迭香酸 108.35±2.18＊＊ 157.97±5.98＊ 372.93±4.71迷迭香酸 507.85±1.56＊＊ 161.47±4.21＊＊381.70±12.53＊

2.4 迷迭香酸對大鼠血清SOD和GSH－Px活力的影響

模型組與假手術組比較，血清SOD活性顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，葛根素50mg／kg使血清SOD活性增加1.16倍，迷迭香酸10和50mg／kg分別使血清SOD活性增加1.12和1.15倍（P＜0.01）。結果見表2。

模型組與假手術組比較，血清GSH－Px活性顯著降低（P＜0.01），與模型組比較，葛根素50mg／kg使血清 GSHPx活性增加1.07倍，迷迭香酸50mg／kg使血清GSH－Px活性增加1.06倍（P＜0.01）。結果見表2。

3 討論

大腦中動脈（MCA）是人群腦缺血的多發部位，MCA閉塞模型被普遍認為是局灶性腦缺血的標準動物模型，而插線法這種模型無須開顱，MCA閉塞效果較理想，是目前能進行再灌流損傷研究的理想動物模型。本實驗采用線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，觀察迷迭香酸對大鼠腦缺血的影響。結果顯示迷迭香酸可減少大腦中動脈阻斷所致的腦梗塞體積，改善腦缺血大鼠的行為障礙。研究結果表明迷迭香酸對腦缺血性損傷具有明顯的保護作用。

涉及再灌注損傷機制的因素有許多，其中氧自由基的生成在其中起重要作用。一般認為，腦缺血時自由基的損害以腦缺血后再灌注為甚，可能是不完全性腦缺血殘留的滴狀供血，提供微量氧氣，使脂質過氧化得以維持進行，加重損害。脂質過氧化的終產物（MDA）有很強的毒性和反應性，它們可使脂質過氧化在細胞膜系統蔓延導致細胞功能的破壞，所以測量脂質過氧化的終產物被認為是氧自由基損傷的重要指標。在正常狀態下，機體ROS的產生和清除間存在著動態的平衡，產生的自由基可被SOD、GSH－Px和過氧化氫酶等清除，測定抗氧化酶類的活性可以間接反應體內清除自由基的能力變化。腦缺血再灌注時，ROS的生成過多，超過了抗氧化酶對它的清除，就會導致氧化應激和細胞損傷。腦缺血大鼠再灌注后，MDA含量明顯升高，SOD和GSH－Px顯著降低，表明腦缺血再灌注期脂質過氧化增加，機體抗氧化能力降低。迷迭香酸能顯著降低MDA含量，提高SOD和GSH－Px的活性，表明迷迭香酸對腦損傷的保護作用與其抗氧化作用有關。

［1］ZHENG W，WANG SY.Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs［J］.J.Agric.Food Chem，2001，49：5165－5170.

［2］ITO H，MIYAZAKI T，ONO M，ET al.Antiallergic activities of rabdosiin and its related compounds：chemical and biochemical evaluations［J］.Bioorg Med Chem，1998，6：1051－1056.

［3］SWARUP V，GHOSH J，GHOSH S，et al.Antiviral and antiinflammatory effects of rosmarinic acid in an experimental murine model of Japanese encephalitis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51：3367－3370.

［4］OSAKABE N，YASUDA A，NATSUME M，et al.Rosmarinic acid，a major polyphenolic component of perilla frutescens，reduces lipopolysaccharide （LPS）－induced liver injury in D－galactosamine（D－GalN）－sensitized mice［J］.Free Radic.Biol.Med，2002，33：798－806.

［5］SANBONGI C，TAKANO H，OSAKABE N，et al.Rosmarinic acid inhibits lung injury induced by diesel exhaust particles［J］.Free Radic.Biol.Med，2003，34：1060－1069.

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［7］IUVONE T，DE FILIPPIS D，ESPOSITO G，et al.The spice sage and its active ingredient rosmarinic acid protect PC12 cells from amyloid－beta peptide－induced neurotoxicity［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，317：1143－1149.

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［9］LEKIEFFRE D，BENAVIDES J，SCATTON B，et al.Neuroprotection afforded by a combination of eliprodil and a thrombolytic agent，rt－PA，in a rat thromboembolic stroke model［J］.Brain Res，1997，776：88－95.