創造酶切位點與PCR-RFLP原理在基因多態檢測中的應用探討

孫東杰，岳馨培，師 樂，孫成林，王 威

(鄭州大學公共衛生學院勞動衛生與職業病學教研室 河南鄭州 450001)

單核苷酸多態性(SNP)指染色體基因組水平上單個核苷酸變異。SNP檢測中，聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態性(PCR－RFLP)技術具有操作簡單、特異性高、重復性好等優點，特別適用于已知突變位點檢測［1］。對無合適內切酶或內切酶價格昂貴時，可引入錯配堿基創造酶切位點(Create restriction site，CRS)方法設計引物，然后進行PCR-RFLP檢測［2］。

該文總結了應用CRS方法結合PCR－RFLP原理對多個SNP檢測方法的研究結果［3－6］，探討了該方法在基因多態檢測中的注意事項，為相關研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 試劑:2×PCR mix(MBI公司)，限制性內切酶MSPI(MBI公司)，瓊脂糖(BBI公司)，引物由上海 Sangon公司合成。儀器:9600型PCR儀(PE公司)，微型電泳槽(Pharmacia Biotech，EPS1000)，Gel Doc 2000凝膠成像儀(Bio－RAD公司)。PCR產物測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法 CRS－PCR－RFLP是根據引物堿基錯配技術設計的檢測單堿基突變的方法。其原理是根據單堿基突變位點的堿基替代情況設計引物，其中一條引物根據突變位點鄰近序列設計，引入錯配堿基，使得引物3’端和單堿基突變的一種突變型在PCR擴增后形成一個酶切位點，然后應用相應內切酶酶切鑒定。

1.3 序列查找及引物設計 在NCBI網站查找基因序列和SNP信息，結合文獻確定多態堿基信息，利用Primer Premier5.0軟件分析內切酶識別情況，設計引入錯配堿基的引物并確定創造的酶切位點。

1.4 PCR擴增及酶切鑒定 取50 ng的基因組DNA、每個引物 0.2 μmol/L、1 × PCRmix、ddH2O 組成25 μl反應體系。PCR反應條件為首先94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s，根據引物Tm值取(55～60)℃退火20 s，72℃延伸20 s，共30個循環后72℃延伸10 min。PCR后，取PCR產物10 μl，加入5 u內切酶和2 μl 10×酶切緩沖液和ddH2O組成20 μl反應體系，37℃水浴2～16 h后，電泳后凝膠成像觀察。

2 結果

2.1 序列搜索與多態位點確定 查找NCBI的SNP數據庫，收集 MGMT、ADH2、MTHFR和 PON2基因全序列及相關多態位點。各基因多態位點情況見表1。

2.2 序列分析與引物設計 經序列分析可知可識別原多態序列的內切酶及其價格情況，對價格較貴者進行錯配分析。通過堿基錯配將多態位點附近堿基進行替換，直至形成可被較廉價內切酶識別的序列。然后根據錯配位點情況確定上下游引物的位置與長度(設計引物、選擇的內切酶及其識別堿基情況見表1)。其中MGMT基因多態rs2308321和rs2308327因位點接近而設計一對特殊引物，兩引物分別進行堿基錯配，PCR后分別采用不同內切酶進行多態鑒定。

2.3 實驗驗證 通過PCR-RFLP實驗驗證，結果與預期一致。不同基因型PCR產物測序結果亦符合預期。

表1 基因多態位點信息與引物設計情況

3 討論

應用CRS-PCR-RFLP進行SNP檢測，拓寬了PCRRFLP的適用范圍，在實際應用中具有很大的靈活性，具有較好的應用前景，特別適合于基層單位開展已知位點SNP的檢測。綜合考慮有關檢測中出現的一些問題，CRS-PCR-RFLP技術的應用需要考慮以下問題。

3.1 SNP情況 SNP一般情況需全面掌握，主要包括基因名稱、染色體位置、rs號、堿基序列及多態堿基替代(氨基酸替代)等。

3.2 內切酶情況 內切酶識別序列和價格因素要考慮，部分識別非回文序列的內切酶識別序列可能在2種以上，盡量篩選價格便宜者以利于推廣。

3.3 擴增產物情況 擴增產物是否存在其他SNP位點、酶切位點個數及其切開后片段長度需考慮。切開后各個條帶之間需具備可分辨性，一般兩片段差異需超過長片段的10%，通常擴增產物長度為100～200 bp?？紤]用瓊脂糖凝膠電泳分辨，價格便宜，易于操作。必要時可考慮聚丙烯酰胺凝膠電泳。

3.4 引物設計的原理和技巧 創造酶切位點方法可用于內切酶價格昂貴或者無內切酶識別的情況，另外可通過錯配堿基消除酶切位點、發夾結構和引物二聚體，或者與序列中其他位點的無關錯配情況。

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