調營飲對化療所致骨髓抑制小鼠造血細胞因子的影響※

鄭仁省

(河北省冀州市醫院中醫科，河北 冀州 053200)

調營飲對化療所致骨髓抑制小鼠造血細胞因子的影響※

鄭仁省

(河北省冀州市醫院中醫科，河北 冀州 053200)

目的觀察調營飲對化療所致骨髓抑制小鼠造血細胞因子的影響。方法將168只清潔級昆明小鼠，隨機分為正常組、模型組、調營飲組、調營飲拆方組、六味地黃湯組、八珍湯組、當歸補血湯組，每組24只。正常組予0.9%氯化鈉注射液0.2 mL腹腔注射，其余各組予注射用環磷酰胺(CTX)100 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續3 d。實驗第4 d，調營飲組、調營飲拆方組、六味地黃湯組、八珍湯組、當歸補血湯組分別給予相應藥液0.2 mL灌胃，正常組、模型組予等容積蒸餾水灌胃，每日1次，連續10 d。分別于實驗第4、7、10 d取小鼠眼球血，測外周血白細胞計數(WBC)、紅細胞計數(RBC)。同時，第7 d采用放射免疫分析法檢測血液中促紅細胞生成素(EPO)，之后取各組小鼠右側股骨，采用免疫組化法觀察粒－巨噬細胞集落刺激因子(GM－CSF)平均光密度值。結果實驗第4、7 d模型組及各藥物組WBC均低于正常組(P＜0.05)。實驗第10 d，模型組、調營飲拆方組、六味地黃湯組及當歸補血湯組WBC均低于正常組(P＜0.05)。模型組各時間RBC均低于正常組(P＜0.05)。實驗第4 d，調營飲組、調營飲拆方組及八珍湯組WBC較模型組升高(P＜0.05);調營飲拆方組、六味地黃湯組RBC與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。實驗第7 d，調營飲組、八珍湯組WBC與模型組比較均明顯升高(P＜0.05);調營飲組、調營飲拆方組RBC高于模型組(P＜0.05)。實驗第10 d，各用藥組WBC、RBC與模型組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，且調營飲組WBC高于調營飲拆方組、六味地黃湯組和當歸補血湯組 (P＜0.05)，調營飲組RBC高于其他各用藥組(P＜0.05)。模型組EPO高于正常組(P＜0.05)，GM－CSF平均光密度值低于正常組(P＜0.05)。各用藥組EPO、GM－CSF平均光密度值與模型組比較均有統計學意義(P＜0.05)，且調營飲組EPO、GM－CSF平均光密度值均高于其他各藥物組(P＜0.05)。結論調營飲可明顯提高化療致骨髓抑制小鼠EPO分泌及GM－CSF的表達，從而改善外周血細胞狀況，促進骨髓造血功能恢復。

骨髓疾病;疾病模型，動物;環磷酰胺;中藥療法;造血系統

骨髓抑制是化療常見的副作用。目前，西醫學常采用口服升白藥物(如利血生、鯊肝醇、維生素B4等)，輸注成分血或進行造血干細胞移植。但這些方法作用短暫且價格昂貴不易推廣。為此，我們運用中醫理論，根據骨髓抑制的臨床表現，并結合臨床實踐，創制了具有滋腎填精、健脾益氣兼活血養血功效的中藥方調營飲。本研究通過對骨髓抑制小鼠予調營飲干預，以探討調營飲對骨髓抑制小鼠造血細胞因子的影響，為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級昆明小鼠168只，雌雄各半，體質量(20±2)g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:803103。常規飼養，自由飲食。

1.1.2 實驗試劑及儀器 注射用環磷酰胺(CTX)(山西普德藥業有限公司，國藥準字H14023686)200 mg加0.9%氯化鈉注射液配制成濃度10 mg/mL溶液，第一抗體粒－巨噬細胞集落刺激因子(GM－CSF)兔抗IgG多克隆抗體(博士德公司)，促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)放免試劑盒(北京普爾偉業生物科技有限公司)，第一抗體SP 9001試劑盒及DAB顯色劑(北京中衫金橋生物技術有限公司)。

1.1.3 實驗藥物 調營飲:熟地黃25 g，山茱萸10 g，山藥 30 g，黃芪 10 g，當歸 10 g，雞內金 10 g，黃精 10 g，何首烏10 g，丹參10 g，雞血藤10 g。調營飲拆方:調營飲減丹參、雞血藤。六味地黃湯:熟地黃24 g，山茱萸12 g，山藥12 g，茯苓9 g，牡丹皮 9 g，澤瀉 9 g。八珍湯:當歸 10 g，川芎5 g，白芍藥8 g，熟地黃 15 g，人參 3 g，白術 10 g，茯苓8 g，甘草5 g。當歸補血湯:黃芪30 g，當歸6 g。以上生藥均同一批購自河北醫科大學第四醫院中藥房。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 將實驗動物隨機分為7組，即正常組、模型組、調營飲組、調營飲拆方組、六味地黃湯組、八珍湯組、當歸補血湯組，每組24只，雌雄各半。

1.2.2 動物模型制備 昆明小鼠常規飼養5 d后，參照王德俊等［1］方法進行模型制備。正常組予0.9%氯化鈉注射液0.2 mL腹腔注射，其余各組予CTX 100 m g/kg腹腔注射，每日1次，連續3 d。

1.2.3 藥物制備 分別將調營飲、調營飲拆方、六味地黃湯、八珍湯及當歸補血湯按中藥湯劑煎煮方法煎煮濃縮，配制成濃度分別為 4.50、3.83、2.50、2.13、1.20 g/mL 湯劑，置4℃冰箱保存備用。

1.2.4 給藥方法 CTX腹腔注射4 h后，調營飲組、拆方組、六味地黃組、八珍湯組及當歸補血湯組分別給予相應藥液0.2 mL灌胃，正常組和模型組予等容積蒸餾水灌胃，每日1次，連續10 d。由于注射CTX后導致小鼠骨髓抑制，實驗第5 d，模型組、六味地黃湯組各有1只小鼠死亡，6 d八珍湯組死亡2只，8 d當歸補血湯組死亡1只，此5只小鼠不納入統計。

1.2.5 標本采集 分別于實驗后第4、7、10 d給藥6 h后，各組隨機取小鼠6～8只，摘眼球取血20 μL，用Sysmex－800自動血球計數儀自動檢測外周血白細胞計數(WBC)、紅細胞計數(RBC)。同時，第7 d采用放射免疫分析法檢測血液中EPO，之后取各組小鼠右側股骨，采用免疫組化法觀察GM－CSF平均光密度值。

1.2.6 統計學處理 采用SPSS 13.0統計學軟件，計量資料用均數±標準差()表示，采用單因素方差分析法檢驗;組間比較采用SNK－q檢驗。

2 結果

2.1 各組不同時間RBC比較 見表1。

表1 各組不同時間RBC比較×1012/L，±s

表1 各組不同時間RBC比較×1012/L，±s

與正常組同期比較，*P ＜0.05;與模型組同期比較，△P ＜0.05;與調營飲組同期比較，#P ＜0.05

組 別 實驗第4 d 實驗第7 d 實驗第10 d正常組10.99 ±1.09 10.78 ±1.07 10.63 ±1.08模型組 9.25 ±.84* 6.00 ±0.59* 7.05 ±0.60*調營飲組 9.36±0.96 7.88±.90△ 10.94±1.07△調營飲拆方組 10.56±0.82△ 7.54±0.79△ 9.61±0.82△#六味地黃湯組 10.55 ±0.76△ 6.86 ±0.91 7.98 ±0.62△#八珍湯組 9.28 ±.03 7.02 ±0.78 8.07 ±0.77△#當歸補血湯組 9.31 ±0.86 6.35 ±0.62 8.77 ±0.75△#

由1可見，模型組各時間RBC均低于正常組(P＜0.05)。實驗第4 d，調營飲拆方組、六味地黃湯組RBC與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。實驗第7 d，調營飲組、調營飲拆方組RBC高于模型組 (P＜0.05)。實驗第10 d，各用藥組RBC均明顯回升(P＜0.05)，且調營飲組高于其他各藥物組(P＜0.05)。

2.2 各組EPO及GM－CSF平均光密度值比較 見表2。

表2 各組EPO及GM－CSF平均光密度值比較±s

表2 各組EPO及GM－CSF平均光密度值比較±s

與正常組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05;與調營飲組比較，#P ＜0.05

組 別 n EPO(ng/mL) GM－CSF 平均光密度值正常組 8 0.53 ±0.13 0.14 ±0.02模型組 7 1.28 ±0.27* 0.08 ±0.01*調營飲組 8 1.92±0.25△ 0.21±0.02△調營飲拆方組 8 1.68 ±0.16△# 0.18 ±0.02△#六味地黃湯組 7 1.65 ±0.22△# 0.17 ±0.02△#八珍湯組 6 1.57 ±0.14△# 0.15 ±0.03△#當歸補血湯組 8 1.54 ±0.20△# 0.13 ±0.03△#

由表2可見，模型組EPO高于正常組(P＜0.05)，GM－CS平均光密度值低于正常組(P＜0.05)。各用藥組EPO、GM－CSF平均光密度值與模型組比較均有統計學意義(P＜0.05)，且調營飲組EPO、GM－CSF平均光密度值均高于其他各藥物組(P＜0.05)。

2.3 各組不同時間WBC比較 見表3。

表3 各組不同時間WBC比較×109/L，±s

表3 各組不同時間WBC比較×109/L，±s

與正常組同期比較，*P ＜0.05;與模型組同期比較，△P ＜0.05;與調營飲組同期比較，#P ＜0.05

組 別 實驗第4 d 實驗第7 d 實驗第10 d正常組8.53 ± 0.57 8.01 ± 0.67 8.70 ± 0.74模型組 3.13 ± 0.42* 3.51 ± 0.97* 3.99 ± 0.46*調營飲組 4.11 ± 0.59＊△ 5.09 ± 0.81＊△ 8.91 ± 0.96△調營飲拆方組 3.94 ± 0.60＊△ 4.10 ± 0.59* 6.10 ± 0.52＊△#六味地黃湯組 3.81 ± 0.43* 4.06 ± 0.49* 6.35 ± 0.39＊△#八珍湯組 4.26 ± 0.82＊△ 4.63 ± 0.56＊△ 8.21 ± 0.46△當歸補血湯組 3.84 ± 0.63* 4.15 ± 0.62* 5.90 ± 0.60＊△#

由表3可見，實驗第4、7 d模型組及各藥物組WBC均低于正常組(P＜0.05)。實驗第10 d，模型組、調營飲拆方組、六味地黃湯組及當歸補血湯組WBC均低于正常組(P＜0.05)，而調營飲組及八珍湯組與正常組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。實驗第4 d，調營飲組、調營飲拆方組及八珍湯組WBC較模型組升高(P＜0.05)。實驗第7 d，調營飲組、八珍湯組WBC與模型組比較均明顯升高(P＜0.05)。實驗第10 d，各用藥組WBC與模型組比較差異均有統計學意義(P＜0.05);調營飲拆方組、六味地黃湯組、當歸補血湯組WBC均低于調營飲組(P＜0.05)，而八珍湯組與調營飲組比較差異無統計學意義 (P＞0.05)。

3 討論

CTX為是臨床常用的抗腫瘤藥物，對多種腫瘤細胞具有抑制作用。其作用機制為細胞周期非特異性藥物。在體外無抗癌效果，需在體內經肝微粒體混合功能氧化酶活化后，產生具有烷化活性的磷酰胺氮芥，發揮其細胞毒作用［2］。骨髓抑制為其主要的不良反應之一，表現為WBC、RBC減少，嚴重時全血細胞減少。故本實驗采用CTX腹腔注射，復制骨髓抑制模型，操作方法簡單，重復性好。WBC、RBC能直接反映機體血液細胞的情況，間接反映骨髓造血功能及藥物對骨髓造血功能的影響，可作為評價藥物對造血功能影響的重要指標。

骨髓紅系細胞的正常分裂、分化和成熟受多種細胞因子的調控，其中EPO發揮關鍵性作用。EPO主要是由腎臟近曲小管細胞和腎皮質、外層髓質的小管周圍毛細內皮細胞分泌的一種具有生物學效能的糖蛋白，與集落刺激因子(CSF)和白細胞介素(IL)相比，EPO作用的細胞譜系最具特異性。EPO能特異性刺激紅系造血細胞的生長、分化和增殖［3］，從而促進WBC生成。本實驗小鼠經CTX腹腔注射后，外周血RBC明顯低于正常組，而EPO卻高于正常組，推測可能是CTX腹腔注射導致小鼠貧血，反射性的促進了EPO的合成所致。GM－CSF是由激活的T淋巴細胞、成纖維細胞和巨噬細胞等產生的一種糖蛋白，對早期造血祖細胞具有廣泛增殖、促進活性作用。同時，GMCSF有種屬特異性，主要作用于髓系祖細胞，通過與其高親和力受體結合發揮生物學效應，使其迅速進入細胞周期向粒系及巨噬系分化，最后成為成熟細胞，并能延長成熟細胞的壽命，增強成熟細胞的功能［4］。重組人GM－CSF已廣泛運用于臨床，常用于治療癌癥化療所致的骨髓抑制、再生障礙性貧血及白細胞減少癥等［5］。

中醫學認為，化療所致的骨髓抑制屬中醫學血虛、虛勞范疇，病機為腎虛精虧，脾虛兼血瘀。治宜滋腎填精，健脾益氣，養血活血［6］。調營飲重用熟地黃補腎養血，益精填髓，培補先天，為君藥;山藥、黃芪、當歸健脾益氣補血以培后天，山茱萸、黃精、何首烏補益肝腎精血，以合乙癸同源，精血互生之理，達先后天同治，脾腎共補，氣血共調之目的，為臣藥;雞內金健脾消食，以助運化，丹參、雞血藤養血活血，祛瘀生新，以助氣血化生，為佐藥。諸藥配伍，有滋腎填精健脾益氣，兼活血養血功效。實驗研究證明，調營飲可改善化療所致骨髓抑制小鼠外周血象及骨髓有核細胞，促進骨髓造血功能恢復及增強免疫功能［6－7］。

本實驗結果表明，調營飲可明顯提高化療致骨髓抑制小鼠EPO分泌及GM－CSF的表達，從而改善外周血細胞狀況，促進骨髓造血功能恢復。

(指導老師:劉亞嫻)

［1］王德俊，盛樹青，李瑞琴，等.螺旋藻多糖對環磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的實驗研究［J］.中國臨床藥理學與治療學，2001，6(1):46－48.

［2］周際昌.實用腫瘤內科學［M］.2版.北京:人民衛生出版社，1999:234－235.

［3］中華內科雜志編委會.全國造血生長因子與細胞因子在血液病的應用研討會紀要［J］.中華內科雜志，1994，33(5):336－338.

［4］尉達民，王良緒，陳萍生，等.rhIL－6，rhGM－CSF和rhEPO對人造血干細胞的作用［J］.中華內科雜志，1994，33(5):298－301.

［5］陳陵，鄒霓，段美華.造血生長因子的臨床應用［J］.中國實用兒科雜志，1996，11(4):241－242.

［6］鄭仁省.調營飲對化療所致骨髓抑制小鼠外周血象及骨髓有核細胞的影響［J］.河北中醫，2011，33(1):104－108.

［7］鄭仁省，劉亞嫻.調營飲對化療所致骨髓抑制小鼠造血調控的影響［J］.中醫藥通報，2010，9(6):57－60.

Investigation of Tiaoyangyin on hematopoietic cytokines in mice of chemotherapy－induced bone marrow suppression

ZHENG Rensheng.Department of Traditional Chinese Medicine，Hebei Jizhou Hospital，Hebei，Jizhou053200

ObjectiveTo investigate the effect of Tiaoyangyin on hematopoietic cytokines in mice of chemotherapy－ induced bone marrow suppression.Methods168 mice were randomly seven groups，control group，model group，Tiaoyangyin group，Tiaoyangyin Decomposed Recipes group，Rehmanniae Decoction of Six Ingredients group，Decoction of Eight Ingredients group and Angelicae Sinensis Decoction for Supplementing Blood group.There were 24 mice in each group.Control group

intraperitoneal injection of 0.9%sodium chloride injection 0.2 mL，the rest of the group received intraperitoneal injection of cyclophosphamide(CTX)100 mg/kg，once a day，continuous 3 days.Experiment No.4 d，Tiaoyangyin group，Tiaoyangyin Decomposed Recipes group，Rehmanniae Decoction of Six Ingredients group，Decoction of Eight Ingredients group and Angelicae Sinensis Decoction for Supplementing Blood group were given 0.2 mL of corresponding liquid fed，the normal group and model group were given equal volume of distilled water，once a day，continuous 10 d.White blood cell count(WBC)and red blood cell count(RBC)in peripheral blood from eye of mice blood at experiment No.4，7 and 10 d.while blood erythropoietin(EPO)were detected by radioimmunoassay at the first 7 d.Mean optical density value of GM－CSF from the right femur of mice were observed using immunohistochemical staining.ResultsWBC in model group and each treatment group was lower than that in control group at experiment No.4 and 7 d(P＜0.05).WBC in model group，Tiaoyangyin Decomposed Recipes group，Rehmanniae Decoction of Six Ingredients group and Angelicae Sinensis Decoction for Supplementing Blood group was lower than that in control group at experiment No.10 d(P＜0.05).There was no significant difference between Tiaoyangyin group，Decoction of Eight Ingredients group and control group on WBC(P＞0.05).RBC in model group was lower than that in control group at difference time(P＜0.05).WBC in Tiaoyangyin group，Tiaoyangyin Decomposed Recipes group and Decoction of Eight Ingredients group was higher than that in control group at experiment No.4 d(P＜0.05).There was significant difference between Tiaoyangyin Decomposed Recipes group，Rehmanniae Decoction of Six Ingredients group and model group on RBC(P＜0.05).WBC in Tiaoyangyin group and Decoction of Eight Ingredients group was significantly increased in comparison with that in model group at experiment No.7 d(P＜ 0.05).There were significant differences between each treatment group and model group on WBC and RBC at experiment No.10 d(P＜0.05).There were significant differences between each treatment group and model group on EPO and mean optical density value of GM－CSF(P＜0.05).ConclusionTiaoyangyin can significantly increase GM－CSF secretion of EPO expression in mice of chemotherapy－induced bone marrow suppression，thereby improving the status of peripheral blood cells and promote functional recovery of bone marrow.

Bone marrow disease;Disease model;Animal;Cyclophosphamide;Therapy of traditional Chinese medicine;hemopoietic system

R－332;R730.55;R322.2;R283.661

A

1002－2619(2011)07－1055－04

※項目來源:河北省中醫藥管理局2008年度中醫藥、中西醫結合科研計劃項目(編號:2008034)

鄭仁省(1974—)，女，主治醫師，碩士。從事中西醫結合腫瘤臨床與研究。

2011－04－15)