左西孟旦對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護作用

于明懂 高春霖 呂國義 鄧廼封

心臟停搏液在心臟外科手術期間具有良好的心肌保護作用，其作用直接關系到手術成功與否及術后心功能的恢復情況。左西孟旦（1evosimendan，Levo）是新一代Ⅱ型鈣離子（Ca2+）增敏劑，對缺血-再灌注心肌有良好的保護作用，能開放ATP敏感的K+通道（KATP）而具有藥物學缺血預處理作用[1]。本研究旨在觀察在去極化心臟停搏液中加入不同濃度左西孟旦對缺血再灌注心肌損傷的影響，并分析其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 健康雄性Wistar大鼠32只，體質量250～300 g，購于北京軍事醫學科學院實驗動物中心，清潔級，隨機分為4組（n=8），L0組為對照組：用去極化停搏液St.Thomas’Ⅱ（STH-2）停搏；L0.03組：STH-2中加入 Levo 0.03 μmol/L；L0.3組：STH-2加入Levo 0.3 μmol/L；LG組：STH-2中加入Levo 0.3 μmol/L和格列苯脲10 μmol/L停搏。

1.2 主要試劑及儀器 左西孟旦（常州亞邦制藥有限公司），格列苯脲（上?；瘜W試劑廠）。K-H液（mmol/L）:NaCl 118.5、KCl 4.8、葡萄糖 11.0、CaCl21.8、KH2PO41.2、NaHCO325.0、Mg?SO4·7H2O 1.2。STH-2 停 搏 液（mmol/L）:NaCl 110.0、KCl 16.0、CaCl21.2、NaHCO310.0、MgCl·26H2O 16.0（所有試劑均為國產分析純）。磷酸肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。改良Langendorff灌注模型（國產自組裝）；BS223S電子分析天平（北京賽得利斯儀器系統有限公司），cc7-104-23-017型DATEX多功能監測儀（Datex公司,芬蘭），SCW-PTO1型壓力傳感器（深圳益心達醫學新技術有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立 于大鼠腹腔注射3%戊巴比妥30 mg/kg、肝素500 IU/kg，麻醉后迅速開胸取出心臟，放入盛有4℃K-H液的玻璃皿中，修剪主動脈根部周圍組織，游離主動脈，懸掛于改良Langendorff心臟灌流裝置上，結扎固定，恒壓灌注，剪開肺動脈圓錐以開放冠脈流出道，剪開左心耳，將與壓力傳感器連接的乳膠水囊經左心房通過二尖瓣置于左心室，然后將心臟置于37℃保溫缸內，向球囊內緩慢注入生理鹽水，調解乳膠水囊壓力，使左心室舒張末壓（LVDP）維持在8～10 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。各組均由主動脈恒壓灌注預先升溫至37℃，并用95%O2與5%CO2混合氣體持續充氣平衡30 min的K-H液，灌注壓力為90 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）。30 min后分別用相應25℃心臟停搏液誘導心臟停搏，灌注流量為15 mL/kg，灌注壓為90 cm H2O，每30 min灌注1次。停搏期間各組心臟分別浸泡在相應的25℃恒溫的停搏液中，120 min后以K-H液恢復灌注30 min。

1.3.2 測量及觀測指標 測定心臟停搏前即刻（T0）、再灌注10 min（T1）、20 min（T2）、30 min（T3）時的心率（HR）、LVDP及左心室內壓力上升/下降速率（±dp/dtmax），并以T0時各項指標作為基礎值計算再灌注后各時間點的恢復率（當前值/基礎值）。留取T0、T32個時間點冠脈流出液2 mL，用于檢測LDH和CK。

1.4 統計學方法 應用SPSS 17.0軟件包進行統計學分析，數據以均數±標準差±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血流動力學指標恢復率的比較 各組心功能基礎值差異無統計學意義（P>0.05）；再灌注期各組心功能都有不同程度的降低，L0.3組LVDP、±dp/dtmax的恢復率均高于其他3組（P<0.05或P<0.01），HR的恢復率明顯高于L0組（P<0.01），L0.03組、LG組與L0組比較HR、+dp/dtmax的恢復率差異無統計學意義（P>0.05），-dp/dtmax恢復率在T2時點高于L0組（P<0.05），見表1～3。

表1 缺血前即刻各組心功能指標比較 （n=8，±s）

表1 缺血前即刻各組心功能指標比較 （n=8，±s）

均P>0.05

L0組L0.03組L0.3組LG組F HR（次/min）283.63±14.06 280.75±16.10 281.50±10.94 282.38±11.61 0.069 LVDP（mm Hg）89.44±3.19 88.56±2.50 89.90±4.01 88.87±4.53 0.212+dp/dtmax（mm Hg/s）2 407.07±168.19 2 336.69±206.72 2 382.80±189.83 2 374.38±209.63 0.181-dp/dtmax（mm Hg/s）1 450.10±148.05 1 408.13±176.18 1 424.63±152.70 1 431.87±168.18 0.093組別

表2 再灌注期各時間點HR、LVDP恢復率比較（n=8，%±s）

表2 再灌注期各時間點HR、LVDP恢復率比較（n=8，%±s）

*P<0.05，**P<0.01；表3～4同

L0組（1）L0.03組（2）L0.3組（3）LG組（4）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）T1 86.00±2.64 87.89±1.80 90.55±2.18 88.42±4.08 3.558*1.909 4.596**2.444 2.687 0.535 2.152 T2 89.80±2.84 90.70±2.52 93.88±1.00 91.48±3.56 3.471*0.961 4.354**1.793 3.394*0.832 2.561 T3 86.79±3.09 88.89±3.44 91.63±3.16 89.61±3.43 2.956*1.809 4.16**2.429 2.360 0.620 1.740 T1 45.55±3.47 48.13±3.25 55.83±2.88 49.59±2.90 11.386**2.027 8.075**3.174 6.049**1.147 4.870**T2 55.42±3.01 61.49±3.11 73.47±3.23 59.79±3.65 20.431**4.230*12.578**3.045 8.307**0.488 9.533**T3 54.89±2.94 60.94±2.76 72.30±3.41 58.37±3.86 18.754**4.356*12.534**2.505 8.179**1.850 10.029**HR LVDP組別

表3 再灌注期各時間點±dp/dtmax恢復率比較（n=8，%±s）

表3 再灌注期各時間點±dp/dtmax恢復率比較（n=8，%±s）

L0組（1）L0.03組（2）L0.3組（3）LG組（4）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）T1 45.34±3.96 47.92±5.10 56.27±4.75 49.64±5.35 7.501*1.514 6.414**2.523 4.900**1.009 3.891*T2 58.03±4.50 60.32±4.04 75.69±3.46 61.17±5.18 27.418**1.492 11.509**2.046 10.016**0.554 9.462**T3 57.22±3.32 60.56±3.02 73.57±3.74 59.70±4.96 29.393**2.466 12.069**1.831 9.604**0.635 10.239**T1 46.87±3.69 48.70±4.39 57.24±3.48 48.16±3.28 12.872**1.387 7.862**0.978 8.540**0.409 6.884**T2 55.96±3.47 60.54±3.16 71.72±3.65 59.75±4.34 27.186**3.517*12.101**2.910*8.584**0.607 9.191**T3 55.31±1.84 58.90±4.00 68.28±4.71 57.35±3.60 19.374**2.755 9.953**1.565 7.198**1.189 8.388**+dp/dtmax -dp/dtmax組別

2.2 CK和LDH漏出量的比較 各組CK及LDH基礎值比較差異無統計學意義（P>0.05），復灌后各組CK及LDH漏出量均明顯升高（P<0.01），L0.3組漏出量少于其他3組（P<0.05或P<0.01），L0.03組與L0組相比也明顯減少（P<0.05），LG組與L0組、L0.03組相比差異均無統計學意義（P>0.05），見表4。

表4 各組CK和LDH測定結果比較（n=8，U/L±s）

表4 各組CK和LDH測定結果比較（n=8，U/L±s）

T3t T0T3t T0 CK LDH組別57.28±7.17 50.39±4.72 44.10±5.17 51.68±5.00 7.466**3.480*6.658**2.829 3.177*0.647 3.829*11.955**12.658**10.320**13.661**125.66±15.37 122.79±17.17 119.91±12.65 120.59±15.28 0.233- - - - --237.33±22.51 215.29±21.95 194.11±16.17 220.29±18.51 6.368**3.124*6.126**2.415 3.002*0.709 3.717*19.321**12.777**13.777**17.161**21.53±2.16 22.18±2.45 20.90±3.81 20.62±3.58 0.408- - - - --L0組（1）L0.03組（2）L0.3組（3）LG組（4）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）

3 討論

去極化高鉀停搏液應用于心外手術已有幾十年歷史，高鉀停搏液可以使心臟快速停搏，由于其配制簡便和費用低廉，在臨床上得到廣泛地應用。高鉀心臟停搏液的缺點是可以造成心肌局灶性壞死和冠狀動脈內皮細胞的損傷，同時由于STH液在較長的心臟外科手術中常需多次灌注，因而可加重心肌水腫，造成心肌損害[2]。近年來，國內外的研究證明在停搏液中添加藥物成分對心肌具有額外保護的作用，如左旋卡尼汀[3]、丹參[4]等。

心肌細胞KATP分為肌漿網KATP（sacrKATP）和線粒體KATP（mitoKATP），發揮作用的方式各有不同。導致細胞不可逆損傷的根本原因是線粒體Ca2+超載。線粒體高濃度的Ca2+導致線粒體滲透性轉換孔永久性開放，它允許高分子質量的物質出入線粒體，使線粒體內容物喪失，膜電位永久消失，水分子大量進入線粒體內，導致線粒體腫脹甚至崩解[5]。

Levo是新一代Ⅱ型Ca2+增敏劑，不同的濃度下具有Ca2+增敏、開放KATP、抑制磷酸二酯酶、促進NO合成及抗炎抗氧化等作用[6]。在心臟，Levo可激活sacrKATP而產生舒張冠狀動脈的作用[7]。Levo也可激活mitoKATP通道引起線粒體K+內流，從而具有藥物缺血預處理作用[1]。Levo具有很好的藥理學預處理作用，能夠減小心肌的再灌注損傷[8]。mitoKATP比sacrKATP在心肌保護中的作用更重要，Levo激活mito?KATP通道是其產生心肌保護作用的基本機制，mito?KATP通道的開放通過調節線粒體內鈣超載而發揮了有益的作用。當mitoKATP通道短暫開放時，導致K+凈攝入增加從而耗散線粒體內膜電位，使電子傳遞解偶聯，降低Ca2+在線粒體內的積聚，最終阻止線粒體內Ca2+超載。

LVDP、±dp/dtmax、HR是心功能的主要參數，本研究比較各心功能指標的恢復率，能準確地反映出心功能的恢復情況，增加了可比性。CK、LDH是與心肌損傷密切相關的酶，心肌組織壞死時血清CK、LDH含量明顯升高，且上升幅度可在一定程度上反映心肌細胞損傷程度。本研究結果表明，再灌注后L0.3組的各時間點心功能指標恢復率明顯高于L0組，再灌注末冠脈流出液中CK和LDH的含量明顯低于L0組，表明加入Levo后再灌注期心肌細胞的損傷得到了明顯的改善。同時L0.3組與L0.03組、LG組相比心功能恢復率、CK和LDH的含量均有不同程度的改善，而L0.03組與L0組相比，CK和LDH的水平均下降，說明Levo的作用效果和其濃度有一定關系，0.3 μmol/L濃度的心肌保護效應優于0.03 μmol/L。格列苯脲為KATP特異阻滯劑，加入格列苯脲以后Levo對缺血再灌注心肌的保護作用幾乎被消除，提示開放KATP為Levo發揮心肌保護作用的主要途徑。

筆者認為在去極化停搏液中加入Levo后，其發揮作用的主要方式為激活mitoKATP穩定了線粒體膜，在長時間的心臟停搏期減少離子紊亂，從而減少線粒體水腫和鈣超載，保護了線粒體的結構和功能。有助于改善再灌注后心肌能量代謝紊亂，發揮心肌保護作用。而激活sacrKATP產生的冠脈舒張作用在此心肌停跳期間發揮的作用甚微。由于本研究是實驗研究，與臨床研究有一定差異，加之實驗條件和環境有限，實驗分組和例數較少,未進行光鏡、電鏡下的比較等，因此有關內容還需進一步研究。

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