鴨綠江鯉魚種質資源的微衛星分析

閆春梅，張雅斌，鄭 偉*，孫效文，常玉梅，毛瑞鑫，劉慧吉，李忠強，肖志國

（1.吉林省水產科學研究院，長春 130033；2.中國水產科學研究院黑龍江水產所，哈爾濱 150070）

鯉魚（Cyprinus carpio）是我國分布最廣、地方種群和養殖品種最多的一種淡水魚，其養殖歷史悠久，養殖產量在水產養殖業中占相當大的比重。近年來，由于酷魚濫捕、環境污染等不利因素，江河等野生環境中的鯉魚資源瀕臨枯竭，嚴重影響野生資源的生物多樣性。隨著國家對野生水生生物資源的重視，采取了增殖放流等措施以恢復野生環境中的資源量。由于有些地區缺乏對野生種質資源的保護意識、管理措施和必要的鑒定技術手段，通過人工放流以及養殖品種的逃逸，使養殖鯉魚品種（如建鯉）進入鴨綠江自然水域，在一定程度上造成野生鯉魚種質資源的混雜。

微衛星（Microsatellite DNA）通常以1～6個堿基為核心序列。具有多態性高、共顯形、檢測重復性好、易于鑒定等優點，目前已廣泛用于魚類遺傳多樣性的研究[1]，如鯉魚[2]、大麻哈魚[3]、烏蘇里白鮭[4]。本研究采用17對微衛星分子標記，以黑龍江野鯉（HLJL）作為陽性對照、建鯉（JL）作為陰性對照，對2批采自鴨綠江的鯉魚（YL1，YL2）進行遺傳多樣性的分析，對其雜合度等數據進行統計分析，以期通過對鴨綠江野生鯉魚現存群體的種質鑒定，了解鴨綠江鯉魚的遺傳結構特征、種群歷史，為其遺傳資源的保護提供較為準確的相關信息和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚鰭條樣本

本試驗4個鯉魚群體樣本分別采自鴨綠江，其中YL1 38尾，采于2009年4月；YL2 28尾，采于2010年4月；鯉的選育品系建鯉30尾，采于2009年4月。黑龍江撫遠江段野鯉28尾，DNA樣品由黑龍江水產研究所提供；鰭條樣本均保存于70%乙醇溶液。

所有樣本同步試驗。

1.1.2 試劑

微衛星引物，由上海生物工程技術服務有限公司合成；PCR所用試劑購自于長春TaKaRa公司；其他試劑為國產藥品。

1.2 方法

1.2.1 DNA制備

分別對96尾采自鴨綠江的鯉魚鰭條樣本進行DNA提取，每20 mg鰭條加入0.6 mL裂解液（0.5%十二烷基肌胺酸鈉，10 mmol·L－1EDTA（pH 8.0），200 μg·mL－1蛋白酶 K），55 ℃溫育 1～2 h，并不時輕搖至組織塊完全消化，取上清用酚、氯仿、異戊醇混合液（25∶24∶1）抽提 3遍，之后用無水乙醇－20℃過夜沉淀，再用預冷的70%乙醇洗滌1次，自然干燥后加 50～100 μL 0.1×TE（pH 8.0）溶解DNA，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA提取質量，并黑龍江水產研究所提供的28尾鰭條DNA樣本一起4℃保存備用。

1.2.2 引物

本研究所用的引物均由黑龍江水產研究所提供，微衛星引物序列及復性溫度見表1。

表1 微衛星引物序列Table 1 Microsatellite marker sequence

1.2.3 PCR反應程序及產物檢測

PCR擴增反應總體積為15 μL，反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性20 s，退火20 s（根據引物設定），72℃延伸30 s（擴25個循環）；72℃延伸10 min。

PCR擴增產物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，120 V電泳2～5 h。取下凝膠，用0.1%硝酸銀染色液染色，顯色后用照相機記錄電泳結果，對擴增條帶進行分析，記錄。

1.2.4 數據分析

根據所獲得的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果，應用Popgen32軟件，進行等位基因頻率；平均觀測雜合度；平均期望雜合度；有效等位基因數；遺傳相似系數；群體間遺傳距離等參數計算。再利用PIC計算軟件計算平均多態信息含量。

2 結果與分析

2.1 DNA制備結果

對96尾采自鴨綠江的鯉魚鰭條樣本進行DNA提取，結果顯示所提取DNA條帶清晰，質量較好。抽取的部分樣本DNA瓊脂糖凝膠電泳見圖1。

2.2 PCR擴增結果

17個微衛星標記均能較好的擴增出目的條帶。每個座位檢測到1～5個等位基因，均表現為多態。引物HLJ036和HLJ338在4個群體的PCR擴增結果見圖2。

圖1 部分DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Part of DNA agarose gel electrophoresis

圖 2 引物HLJ036（a）和HLJ338（b）在4個群體的PCR擴增結果Fig.2 PCR profile of HLJ036(a)and HLJ338(b)in four populations

2.3 遺傳多樣性分析

依據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果，利用Popgen32軟件，計算得出4個群體的微衛星座位分析檢測值。檢測結果顯示，平均觀測雜合度為0.5441～0.6563，平均期望雜合度為0.6362～0.6566，有效等位基因數為2.9182～3.0124，平均多態信息含量為0.5728～0.5885，群體間相似系數在0.8747以上，說明這幾個群體屬于高度多態，相似性較高。聚類分析顯示，HLJL與YL1遺傳距離最小，親緣關系最近。建鯉與其他3個群體的遺傳距離較大，親緣關系較遠（見表2，圖3）。

表2 鯉魚4個群體的遺傳距離和相似性指數Table 2 Genetic identity and genetic distance in four populations

圖3 4個鯉魚群體的UPGMA聚類Fig.3 Dendrogram of the four populations using UPGMA method

3 討 論

微衛星研究方法是近幾年來廣為應用的遺傳分子標記，變異水平較高，且可通過PCR獲得多肽信息[5]，與同工酶等方法相比，更適合親緣關系較近的種群遺傳關系分析[6－7]。

本研究的目的是鑒別從鴨綠江捕獲的兩批鯉魚是否為野生品種。對經鑒定確系野生品種的鯉魚進行人工增殖放流，以增加天然水域的野生品種覆蓋率。由于在養殖品種當中，框鏡鯉等養殖種類鯉魚在生物學性狀上與野生鯉魚具有較大差異，可以在眼觀上進行辨別，只有建鯉的體長、體色等生物學性狀與野生鯉魚類似，與野生鯉魚在外觀上很難區分，切培育時間長，目前在整個鴨綠江流域廣泛養殖，數量巨大，很容易與野生鯉魚混淆，因此，選擇了建鯉作為養殖品種的代表進行對比鑒定。

為篩選鴨綠江流域自然環境中野生鯉魚親本，根據鴨綠江流域的可能存在的鯉魚品系設計本試驗。首先考慮到流域內網箱養殖可能逃逸的養殖品種，多年來該流域養殖品種為建鯉，設為陰性對照。以已知的野生的、生存環境相似的鯉魚－黑龍江野鯉作為陽性對照，先后對66尾捕自鴨綠江流域的鯉魚親魚進行檢測。結果表明，所采捕的兩批鴨綠江鯉魚與建鯉處在不同的分支上，與黑龍江野鯉處于同一進化分支上，從表2可見，YL1與的遺傳相似指數最高，達到0.9489，YL2與HLJL的遺傳相似指數也達到0.9180，顯著高于與JL的遺傳相似指數，因此可以說，兩批鴨綠江鯉魚與黑龍江野鯉親緣關系很近，因此，認為所采捕的兩批鴨綠江鯉魚均為野生品種，可以用與增殖放流。

微衛星方法是檢測共顯性遺傳特征的分辨率很高的較新遺傳學研究方法，目前已成為種群遺傳結構與進化分析的有效分子標記[8－9]。本研究試驗結果顯示，本研究中的4個鯉魚群體平均觀測雜合度均在0.5以上，平均期望雜合度高于0.6。平均雜合度是被檢測位點上群體的雜合子頻率，用于檢測群體內遺傳變異，是群體雜合程度的度量單位[10－11]。本研究中4個群體的平均雜合度均高于0.5，表明各群體的遺傳多樣性均較高，尤其是YLI，YL2和HLJL三個群體，具有較豐富的育種和遺傳改良潛力，應采取相應措施予以保護。

除了雜合度以外，微衛星還可以通過平均多肽信息含量（PIC）來檢測位點多態性。當PIC＞0.5時，為高度多態位點；0.25＜PIC＜0.5時為中度多態位點；PIC＜0.25時為低度多態位點[12－13]，本研究中4個群體的平均多態信息含量為0.5728～0.5885，證明本試驗中所選微衛星位點都具有高多態性?？梢杂行У赜糜谌后w遺傳結構分析。

微衛星方法采用Fis值來衡量群體內雜合程度。對本研究的4個群體的分析表明，4個群體均表現為一定程度的雜合度缺失，造成這一結果的原因可能是試驗中所測樣本的含量較少，因為試驗中所測樣本含量過少，無效等位基因的存在等原因都可能導致雜合度計算值偏低[14－15]。

本研究的目的是鑒定4個鯉魚群體的遺傳關系，確定所采捕的兩批鴨綠江鯉魚是否為野生品種，因此，遺傳距離和遺傳相似度是重要的待衡量指標。在群體的進化研究中，可通過計算遺傳距離來鑒定種間遺傳結構及分化關系。微衛星研究方法認為遺傳距離越遠，分化時間越長，雜種優勢越大，即遺傳距離與分化關系呈正相關。群體間遺傳距離只有高于0.05，才可認為群體間發生了分化，否則認為群體間為分化，可進行群間合并[16-17]。因此，為了保存種間遺傳變異，必須采用切試可行的方法來測定種間遺傳分化。微衛星方法就是較好的可選方法，不僅可以較準確的預測雜種優勢及其優劣性，還可以避免盲目的展開雜交試驗[18]，為現代遺傳育種學研究打下堅實基礎。

4 結論

通過本試驗確定YL1和YL2群體與養殖品系建鯉不處在同一進化分支上，遺傳距離較遠。與黑龍江野鯉群體的遺傳相似性較高，遺傳距離較近，其中YL1與HLJL親緣關系最近。表明所鑒定的兩批采自鴨綠江的鯉魚均系野生品種，可以用來作為人工繁育的親本，其培育出的子一代苗種可以用于放流以增加鴨綠江天然水域的野生鯉魚良種資源，保護自然環境中土著優良品種的質量安全。

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