黑曲霉MAN1基因在大腸桿菌中的表達及酶學性質分析

張 旭，李 璐，曹雨婷，徐 欣，李 杰

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

β－1,4－D－甘露聚糖酶（β－1,4－D－mannan mannanohydrolase EC 3.2.1.7），又簡稱為 β－D－甘露聚糖酶或β－甘露聚糖酶，是一類能夠水解含有β－1，4－甘露糖苷鍵的甘露寡糖、甘露多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等）的水解內切酶[1－3]，屬于一類能夠水解半纖維素而且具有纖維素酶活性的廣譜誘導酶[4]。作為一種新型工業用酶，在食品、醫藥、造紙、飼料和石油等工業領域中有著廣泛的應用前景[5]，作為一種鑒定多糖結構的工具酶[6－7]，對糖工程、植物基因工程等基礎研究有重要用途。

早在20世紀初，就有分解植物甘露聚糖酶的最初報道[8]，從50年代至今研究工作已經從產β－甘露聚糖酶微生物菌株的選育，產酶發酵工藝條件的優化、酶的分離純化和理化特性，酶的作用機理，不同來源酶的特性及應用等方面轉向酶基因的克隆、表達和活性位點等方面。到目前為止，已從不同來源的微生物只分離到大量不同類型和功能的甘露聚糖酶，并對其酶學性質、催化機制以及分子結構等進行了細致的研究[9]。本研究以β－甘露聚糖酶生產菌黑曲霉為材料，克隆甘露聚糖酶基因MAN1，并進行原核表達，以期為甘露聚糖酶的工業化生產探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

黑曲霉菌株（由肇東日成酶制劑有限公司提供）；大腸桿菌E.coli DH5α、BL21，質粒PET－32b均由本實驗室保存；RNAiso Plus、RT－PCR試劑盒、pMD18－T載體、T4DNA連接酶、Prime STAR Taq酶、限制性內切酶、Ladder Marker（購自大連寶生物工程公司）；DNA回收試劑盒（購自北京百泰克生物技術有限公司）；PDA、LB培養基的配制方法參照美國Invitrogen公司Pichia Expression Kit提供的說明書，其他試劑均為國產分析純。

引物參照NCBI上甘露聚糖酶基因序列（XM001400053）設計，由上海生工生物工程技術有限公司合成。為方便克隆，引物的5′端分別添加了限制性酶切位點Eco RⅠ和NotⅠ（加下劃線表示）。引物序列如下：

P1：5′GAATTCATGAAGCTTTCCAACGCCCT3′

P2：5′GCGGCCGCTTAAGCACTACCAATAGC AG 3′

1.2 方法

1.2.1 β－甘露聚糖酶基因cDNA的克隆

黑曲霉在加入魔芋粉的液體PDA培養基中培養，根據RNAiso Plus提供的說明書提取黑曲霉的總RNA。以總RNA為模板，按照RT－PCR試劑盒的說明書，合成cDNA的第一條鏈，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量。以cDNA為模板，用引物P1、P2進行目的基因的PCR反應，反應體系為25 μL，含有 50 ng模板 cDNA，0.2 mmol·L－1dNTP,25 pmol每種引物，5×Prime STAR Loading Buffer，2 U Prime STAR Taq酶。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s進行30個循環的反應；最后，72℃延伸5 min。反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，擴增出約1 200 bp的DNA片段，回收目的條帶，再與pMD－18T連接，轉化大腸桿菌DH5α得到pMD18－MAN1。獲得的陽性克隆經酶切鑒定后送往上海生工測序。

1.2.2 原核大腸桿菌表達載體的構建

大腸桿菌表達載體pET－MAN1的構建過程如圖1所示。以Eco RⅠ、NotⅠ雙酶切pET－32b和pMD18－MAN1載體，分別回收約5 800 bp的大片段和約1 200 bp的MAN1片段，連接，轉化E.coli BL21，挑選陽性克隆，酶切鑒定，構建成大腸桿菌表達載體pET－MAN1。

圖1 大腸桿菌表達載體pET-MAN1的構建Fig.1 Construction of expression vector pET-MAN1

1.2.3 β－甘露聚糖酶的誘導

將轉化得到的重組菌株接于LB培養基中，37 ℃、150 r·min－1，12～16 h 后，取 1%的菌液加入LB中進行二次活化至OD600=0.8時，加入終濃度0.1 mmol·L－1的 IPTG，20 ℃、150 r·min－1條件下培養 2，4 和 6 h，4 000 r·min－1離心 10 min 收集菌體，裂解，取上清和沉淀做SDS－PAGE分析。同時，做未誘導菌株、轉大腸桿菌空菌和轉空載體菌株的對照，分析重組蛋白的表達情況。

1.2.4 β－甘露聚糖酶活性的測定

將誘導培養后的菌體上清用DNS法檢測β－甘露聚糖酶活性[10]。利用比色法測定酶解后還原產物的生成量，表示酶的活力。誘導2，4和6 h的不同菌株粗酶液各0.1 mL，0.9 mL的0.5%槐豆膠溶液(pH 3.5 0.05 mol·L－1磷酸緩沖液配置）置于 70 ℃水浴反應10 min，加入DNS顯色劑3 mL，再沸水浴15 min顯色，冷卻，用蒸餾水定容至15 mL，混勻，在550 nm下測定吸光率。

酶活單位定義：在設定的溫度及pH條件下，1 min從底物溶液中分解產生1 μmol還原糖（表示為還原糖當量）所需要的酶量為一個酶活單位，簡稱IU。

2 結果與分析

2.1 β-甘露聚糖酶基因cDNA的克隆

以黑曲霉的總RNA為模板，用β－甘露聚糖酶基因引物經RT－PCR可擴增出約1 200 bp的目的條帶。如圖2、3所示，其帶紋單一，特異性強，表現出與目的基因大小一致的條帶。將該片段克隆連至pMD18－T并測序。Blast比對結果表明，該序列與GenBank中編號XM001400053的序列相似性為100%，所克隆的分子即為預期的MAN1基因，編碼384個氨基酸的β－甘露聚糖酶。克隆片段的核苷酸序列及編碼多肽序列：

圖2 甘露聚糖酶基因cDNA的克隆Fig.2 Mannanase gene cloning of cDNA

圖3 克隆片段的核苷酸序列及編碼氨基酸序列Fig.3 Nudeotide sequence of doned fragment and its amino acid sequence

經Eco RⅠ、NotⅠ雙酶切pET-MAN1的質粒驗證，得到約5 900 bp和1 200 bp的片段，如圖4所示，表明載體構建成功。

圖4 表達載體PET-MAN1酶切鑒定結果Fig.4 Characterization of expression vector PET-MAN1 with endonucleas

2.3 表達載體的轉化及酶活性鑒定

2.3.1 表達產物的SDS-PAGE分析

將轉化E.coli.BL21獲得的pET-MAN1重組子，37℃條件下，用0.1 mmol·L-1的IPTG誘導2、4、6 h后的SDS-PAGE分析結果表明，在約62 ku處出現與預計大小一致的條帶。未誘導的E.coli.BL21菌和轉空載體的E.coli.BL21則沒有相應的特異條帶，如圖5所示，證明重組蛋白表達成功。

2.3.2 表達產物酶活性的測定

用LB培養基培養重組大腸桿菌，用0.1 mmol·L-1的IPTG誘導2、4、6 h，菌體經酶解破碎后，通過DNS法測定上清液酶活。IPTG誘導6 h時重組菌株酶活達到48 IU·mL-1（見表1）。

表1 不同誘導時間對甘露聚糖酶活性的影響Table 1 Different induction time on the activity of mannan

2.3.3 重組甘露聚糖酶的最適溫度

用DNS法分析在pH 5，不同溫度條件下重組甘露聚糖酶活性變化，并以酶活最高為100%計算相對酶活，證明其最適溫度為55℃（見圖6）。

圖5 誘導表達蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.5 SDS-induced protein polyacrylamide gel electrophoresis

圖6 溫度對甘露聚糖酶酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on activity of mannanase

2.3.4 重組甘露聚糖酶的最適pH

用DNS法分析在55℃，不同pH條件下重組甘露聚糖酶活性變化，并以酶活最高為100%計算相對酶活，證明其最適最適pH為5.5（見圖7）。

圖7 pH對甘露聚糖酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on activity of mannanase

3 討論與結論

重組蛋白的表達系統主要包括真核和原核兩大系統，原核系統主要是大腸桿菌表達系統。大腸桿菌表達系統具有的操作簡單、價格經濟，遺傳背景清楚等優勢使該系統成為高效表達外源蛋白最常用的原核表達系統[11]，但是很多真核基因在原核中很難高效表達，是因為真核基因的一些密碼子對于原核來說可能是稀有密碼子，如：Arg密碼子AGA、AGG、CGG、CGA、UUA；Gly密碼子GGA；Leu密碼子CUA、TTG；Ile密碼子AUA；Ser密碼子UCA等在E.coli中很少使用[12]。本試驗選擇大腸桿菌BL21和pET－32b表達系統，通過與MAN1蛋白的融合，使MAN1在大腸桿菌中得到高效表達，在MAN1基因384個密碼子中，有20個稀有密碼子，其中編碼Gly（G）的有5個，編碼Val（V）的有7個，編碼 Leu（L）的有 6 個，編碼 Arg(R)和 Pro（P）的各一個，稀有密碼子的存在大大降低了蛋白質合成的速率,使蛋白表達量降低。

在微生物中β－甘露聚糖酶的來源非常廣泛，包括細菌、真菌、放線菌等都是甘露聚糖酶的主要來源，真菌來源的β－甘露聚糖酶分子質量大多在45～55 ku，最適 pH 4.0～5.5，最適溫度 55～75 ℃，真菌來源的酶多為酸性酶。本試驗所用黑曲霉提取的β－甘露聚糖酶的分子質量為41 ku，最適反應溫度為55℃，最適反應pH為5.5，在溫度20～60℃、pH 5～9有較大的活性區間。本試驗只對最適反應溫度和最適反應pH做了研究，還可以進一步對溫度和pH的穩定性、底物的種類和質量濃度、離子強度及金屬離子和螯合劑等做出相應的研究。

近年來已經在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、嗜堿芽孢桿菌（Alkalophilic Bacillussp）、里氏木霉（Trichoderma reesei）及熒光假單孢菌（Pseudomonas fluorescence）等中克隆到甘露聚糖酶基因，并把這些基因分別在大腸桿菌中進行了表達研究。結果表明這些基因菌可以再大腸桿菌中表達，并具有甘露聚糖酶的活性。不同菌種測定得到的酶活有很大差異，本研究以RT－PCR的方法成功獲得了來源于黑曲霉的β－甘露聚糖酶基因，并在大腸桿菌中實現了表達，并通過測定得到此酶的最適溫度和最適pH，最高酶活可達到48 IU·mL－1使其為應用于工業奠定了基礎。

[1]Petrus J Z,Moodley V,Rose S H,et al.Production of the aspergillus aculeatusendo－1,4－β－mannanaseina.Niger[J].Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2009(4):611－617.

[2]Zhang Q,Yan X,Zhang L,et al.Cloning,sequence analysis and heterologous expression of a beta－mannanase gene from Bacillus subtilis Z－2[J].Molecular Biology,2006,40(3):418－424.

[3]齊軍茹,廖勁松,彭志英.β－甘露聚糖酶的制備及其應用研究進展[J].中國食品添加劑,2002,6(6):12－15,4.

[4]尤新.功能性低聚糖生產與應用[M].北京:中國輕工業出版社,2004.

[5]吳襟,何秉旺.微生物β－甘露聚糖酶[J].微生物學通報,1999,26(2):134－136.

[6]Mccleary B V.beta－D－Mannosidase from helix pomatia[J].Carbohydrate Research,1983,111(2):297－310.

[7]李劍芳,鄔敏辰,夏文水.微生物β－甘露聚糖酶的研究進展[J].江蘇食品與發酵,2004(3):4－9.

[8]Khalilova E A,Abramov Sh A.Effect of culture media on the composition of free amino acids inSaccharomyces cerevisiaeyeast[J].Prikl biokhim mikrobiol,1985,21(3):293－299.2001,37(5):578－581.

[9]陳小兵,丁宏標,喬宇.β－甘露聚糖酶的酶學性質、工農業應用及基因工程研究[J].中國生物工程雜志,2005,25(S1):156－159.

[10]Bailey M J,Beily P,Poutanen K.Interlaboratory testing of methods for assay of xylannase activity[J].Journal of Biotechnology,1992,23:257－270.

[11]張巍,陳品林,雷明,等.海南坡鹿CDC42 cDNA的克隆、原核表達及純化[J].獸類學報,2011,31(1):97－102.

[12]尹春光,杜立新,趙桂平,等.Mx基因稀有密碼子和mRNA結構及大腸桿菌表達優化[J].遺傳,2009,31(1):75－82.