傳染性造血組織壞死病毒糖蛋白基因的原核表達(dá)及抗原性分析

趙永欣，趙麗麗，劉巍巍，王健楠，李一經(jīng)，喬薪瑗，葛俊偉，劉 敏*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

傳染性造血組織壞死病（Infectious hematopoietic necrosis，IHN）是鮭、鱒魚(yú)類(lèi)一種嚴(yán)重的傳染性疾病。隨著水生動(dòng)物及其產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易，世界范圍內(nèi)的傳染性造血組織壞死病急劇增加，已有報(bào)道在日本、韓國(guó)、中國(guó)、歐洲等地區(qū)檢測(cè)到該病病毒[1－2]。本實(shí)驗(yàn)室從黑龍江省某漁場(chǎng)病魚(yú)組織內(nèi)分離得到傳染性造血組織壞死病毒IHNV－ZYX株（GenBank編號(hào)HM099906），病魚(yú)的癥狀為體色發(fā)黑，眼球突出，腹部膨大，鰭基充血，腹鰭基部的骨胳肌中有“V”形出血斑塊，經(jīng)解剖可觀察到，魚(yú)的鰓絲褪色呈蒼白色，肝、脾、腎褪色。

傳染性造血組織壞死病病毒為傳染性造血組織壞死病的病原體，屬?gòu)棤畈《究疲≧habdoviridae）諾拉彈狀病毒屬（Novirhabdovirus），呈子彈狀，基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA[3－4]。此病毒具有囊膜，其囊膜蛋白（G）是糖基化蛋白，N端具有一段疏水性的信號(hào)肽，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被切除后成為成熟的糖蛋白，糖基化是病毒顆粒在成熟過(guò)程中由宿主細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外所必需的[5]。G蛋白在膜融合及決定病毒毒力方面起著重要作用，還是病毒的主要抗原，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體[6]，刺激細(xì)胞免疫[7]。

本試驗(yàn)將IHNV－ZYX株全長(zhǎng)的G基因（1 527 bp）進(jìn)行了原核表達(dá)，制備了抗G蛋白血清，分析了IHNV G蛋白的抗原性，為進(jìn)一步研究IHNV G基因的免疫保護(hù)作用及診斷試劑和基因工程疫苗的研制奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

毒株、菌株與質(zhì)粒：IHNV－ZYX株為本實(shí)驗(yàn)室分離，CHSE－214細(xì)胞由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局江育林教授惠贈(zèng)，Rosetta（DE3）菌株、pET－30b載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：限制性內(nèi)切酶（購(gòu)自TaKaRa公司）；T4DNA連接酶（購(gòu)自NEB公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG（購(gòu)自Sigma公司）；山羊抗IHNV陽(yáng)性血清由深圳檢疫局劉葒饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank登錄的IHNV基因序列（L40883），設(shè)計(jì)兩對(duì)引物：G基因（1 527 bp）上游引物：Gu 5′GGATCCGATGGACACCATGATCACCAC 3′含有BamHⅠ酶切位點(diǎn),下游引物：Gl 5′CTCGAGGGAC CGGTTTGCCAGGTGATA 3′含XhoⅠ酶切位點(diǎn)。由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30b－G的構(gòu)建

將用CHSE－214細(xì)胞繁殖的IHNV－ZYX株病毒，經(jīng)Trizol裂解后，以氯仿、異丙醇抽提病毒總RNA，RT－PCR方法分別擴(kuò)增得到G基因片段。將G基因PCR產(chǎn)物分別與pMD18－T連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆、測(cè)序。獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒后用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，純化后連接到經(jīng)同樣雙酶切純化的pET－30b載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30b－G。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將 pET30b－G轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.6時(shí)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE分析。

1.2.4 抗體的制備

將 pET30b－G/Rosetta（DE3）重組菌誘導(dǎo)后提取包涵體，經(jīng)SDS－PAGE分離目的片段，將凝膠在0.25 mol·L－1KCl溶液中染色，切下目的膠條并碾碎，加入少量的PBS后反復(fù)凍融3次，離心取上清并測(cè)得G蛋白濃度為3.95 mg·mL－1。以處理后的G蛋白加弗氏佐劑，按參考文獻(xiàn)[8]介紹的方法分3次免疫新西蘭兔，三免后第7天心臟采血，分離血清，－80℃保存。

1.2.5 抗體效價(jià)的檢測(cè)及抗原性分析

用重組G蛋白包被ELISA板，兔抗G蛋白血清和兔陰性血清為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗，OPD顯色。結(jié)果判定:當(dāng)P/N=（陽(yáng)性血清OD490的值－空白孔OD490的值）/（陰性血清OD490的值－空白孔OD490的值）＞2時(shí)，陽(yáng)性血清的最大稀釋度即為血清抗體效價(jià)。同時(shí)用感染IHNV的細(xì)胞培養(yǎng)物包被ELISA板，用同樣的方法測(cè)定G蛋白抗血清與病毒的反應(yīng)性。

將誘導(dǎo)后的G蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜，以山羊抗IHNV陽(yáng)性血清為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG為二抗，進(jìn)行Western－blot分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒pET30b-G的構(gòu)建

以IHNV－ZYX株cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增片段G基因約為1 527 bp，與預(yù)期大小相符。測(cè)序結(jié)果表明通過(guò)RT－PCR方法成功地?cái)U(kuò)增了G目的基因。用Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切pET30b－G質(zhì)粒，分別得到約5 400和1 527 bp的片段，酶切鑒定與預(yù)期相符（見(jiàn)圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒pET30b-G酶切PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Restriction map of pET30b-G

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

結(jié)果見(jiàn)圖 2。重組菌 pET30b－G/Rosetta（DE3）誘導(dǎo)后在約52 ku處出現(xiàn)蛋白條帶，與預(yù)期重組蛋白分子質(zhì)量一致。且一定范圍內(nèi)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸增多，在誘導(dǎo)4 h時(shí)表達(dá)量最大。超聲波處理誘導(dǎo)后菌體，經(jīng)SDS－PAGE分析，菌體在沉淀中有目的蛋白，可知此蛋白以包涵體形式存在。

圖2 重組菌pET30b-G/Rosetta(DE3)表達(dá)蛋白SDSPAGE鑒定結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE profile of pET30b-G/Rosetta(DE3)expressed protein

2.3 抗血清效價(jià)的測(cè)定

將本試驗(yàn)制備的兔抗G蛋白血清作為陽(yáng)性血清，免疫接種前兔血清作為陰性血清，重組G作為抗原，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)。結(jié)果表明抗血清與相應(yīng)的抗原有較強(qiáng)的反應(yīng)性，滿足P/N＞2時(shí)，血清的最大稀釋度分別為1∶25 600，即為制備的兔抗G蛋白血清效價(jià)（見(jiàn)表1）。

表1 間接ELISA檢測(cè)G蛋白結(jié)果Table 1 Indirect ELISA result of inspection

2.4 G蛋白免疫原性的檢測(cè)

用感染IHNV－ZYX株的細(xì)胞培養(yǎng)物包被ELISA板，與兔抗G蛋白的免疫血清進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

從結(jié)果可知，抗G蛋白的兔血清稀釋度為1∶1 600時(shí)，P/N仍大于2。說(shuō)明制備的抗血清與全病毒抗原發(fā)生較強(qiáng)的特異性反應(yīng)，抗G蛋白的免疫血清能夠識(shí)別IHNV抗原，G蛋白具有良好的免疫原性。

重組G蛋白經(jīng)SDS－PAGE轉(zhuǎn)印到NC膜上，山羊抗IHNV血清1∶1 000稀釋作為一抗，HRP兔抗山羊IgG1∶2 000稀釋作為二抗，Western－blotting結(jié)果見(jiàn)圖4。誘導(dǎo)后的G菌體蛋白在52 ku處出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體蛋白無(wú)條帶產(chǎn)生。Western－blotting結(jié)果表明，重組G蛋白可被山羊抗IHNV血清識(shí)別，G蛋白具有良好的反應(yīng)原性。以上兩項(xiàng)結(jié)果說(shuō)明，表達(dá)的G蛋白與天然的IHNV G蛋一樣具有相同的抗原性。

圖3 間接ELISA檢測(cè)抗G蛋白兔血清效價(jià)結(jié)果Fig.3 Result of G protein infected rabbit

圖4 表達(dá)目的蛋白的Western-blotting檢測(cè)Fig.4 Identification of expressed protein by Westernblotting

3 討論與結(jié)論

G蛋白是傳染性造血組織壞死病毒的主要抗原，可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，還可以作為研究IHNV免疫保護(hù)的抗原基因，因此通常選擇G基因作為抗原基因來(lái)構(gòu)建DNA疫苗[7]。有報(bào)道指出肌肉注射G蛋白表達(dá)質(zhì)粒可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平免疫率[9-11]。Lorezen等構(gòu)建了IHNV病毒G蛋白基因的DNA疫苗[12-13]，能夠誘導(dǎo)虹鱒產(chǎn)生75%的較高水平的免疫保護(hù)率。Kim等認(rèn)為該病毒G蛋白一個(gè)氨基酸的改變會(huì)影響病毒的毒力和致病性[14]。因此，G蛋白在傳染性造血組織壞死病毒基因工程疫苗和診斷技術(shù)等方面的研究中是重要的靶蛋白。目前國(guó)內(nèi)對(duì)此研究較少，2009年郭露玲等對(duì)其進(jìn)行了原核表達(dá)但并未分析該蛋白的功能特性[15]，本研究的病毒株IHNV-ZYX為本實(shí)驗(yàn)室獲得的分離株，更深一步地對(duì)其功能進(jìn)行研究是很有必要的。

本試驗(yàn)獲得分離株IHNV-ZYX G基因全長(zhǎng)cDNA序列，而且成功構(gòu)建了表達(dá)IHNV G蛋白大腸桿菌載體系統(tǒng)，可以在IPTG的誘導(dǎo)下大量表達(dá)G蛋白，純化后制備了高效價(jià)的抗血清，兔抗G蛋白的血清可與IHNV特異反應(yīng)，表明G蛋白具有良好的免疫原性。同時(shí)，本試驗(yàn)制備的G蛋白可被山羊抗IHNV陽(yáng)性血清識(shí)別，反應(yīng)條帶單一，說(shuō)明表達(dá)的G蛋白也具有良好的反應(yīng)原性。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，以原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的G蛋白可以作為檢測(cè)抗原，完全可以代替全病毒制備抗原進(jìn)行病毒繁殖，病毒純化等繁瑣工藝，這對(duì)于IHNV在細(xì)胞上繁殖周期長(zhǎng)，繁殖IHNV的細(xì)胞培養(yǎng)難度大具有更重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此，G蛋白可作為IHNV的診斷抗原，為建立診斷檢測(cè)方法，流行病學(xué)調(diào)查等研究奠定了基礎(chǔ)。

分離株IHNV-ZYX G基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得為研究分離株的免疫學(xué)特性及對(duì)其編碼的G基因結(jié)構(gòu)與功能的深入研究奠定基礎(chǔ)，分離株G蛋白具有良好的免疫原性也為IHNV的免疫預(yù)防提供重要的理論基礎(chǔ)。

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