MC3R基因單核苷酸多態(tài)性與蛋用鵪鶉早期屠體性狀關(guān)系的研究

付 晶，白秀娟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

黑素皮質(zhì)素受體3（Melanocortin 3 receptor，MC3R）是 G－蛋白耦聯(lián)受體（G－Protein coupled receptors，GPCRs）超家族的成員之一，是具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的神經(jīng)受體。該受體家族基因有5個MCR亞型（MC1R～MC5R），MC3R是5個MCR中克隆和鑒定最晚的一個受體基因。早期在對嚙齒類動物的研究中發(fā)現(xiàn)，MC3R和MC4R在采食和能量平衡調(diào)控中起關(guān)鍵作用[1]。Butler等對鼠遺傳學(xué)研究表明，敲除MC3R基因的鼠表現(xiàn)為獨(dú)有的代謝綜合癥，超重不明顯但脂肪含量增加了50%～60%，并降低能量消耗[2]?，F(xiàn)已知MC3R基因主要在下丘腦、丘腦、海馬、胎盤、小腸、胰腺、脂肪組織、骨骼肌、腎和心臟等組織表達(dá)，主要生理功能是調(diào)節(jié)采食行為和能量平衡[3]。

盡管有大量的研究表明MC3R與采食行為和能量平衡有關(guān)，但至今仍然沒有將MC3R的功能完全認(rèn)識[4]。目前，MC3R基因已經(jīng)作為畜禽重要生產(chǎn)性狀候選基因來研究，關(guān)于家禽MC3R基因結(jié)構(gòu)及與多態(tài)性相關(guān)的研究已有報道。雞MC3R基因被定位在20號染色體，是一個單拷貝基因，僅含有一個外顯子，無內(nèi)含子，編碼區(qū)序列長978 bp，編碼325個氨基酸，僅在腎上腺表達(dá)[5]。與人和鼠的相應(yīng)蛋白的同源性分別為75.3%和76.8%。蘇毅研究發(fā)現(xiàn)MC3R-1424突變位點(diǎn)對雞的活重、屠體重、胸肌重和腿肌重差異顯著[6]。蔣思文在參考家系雞MC3R中發(fā)現(xiàn)了5個多態(tài)位點(diǎn)，其中基于限制性內(nèi)切酶DdeⅠ的酶切位點(diǎn)導(dǎo)致的基因型對公、母雞的體重及公雞的腹脂含量影響顯著[7]。王彥在8個雞群體中發(fā)現(xiàn)了A1424G的突變，該突變位點(diǎn)導(dǎo)致的基因型對雞的宰前體重、屠體重、胸肌重、腿肌重、腹脂重、皮脂厚及肉質(zhì)性狀中的粗蛋白含量和肌內(nèi)脂肪含量有顯著影響[8]。以上研究表明，MC3R基因的核苷酸變異與雞的體重和屠體性狀存在相關(guān)。

鵪鶉在我國有“動物人參”的美譽(yù)，其蛋、肉營養(yǎng)豐富，味道鮮美，芳香適口[9]。國內(nèi)外關(guān)于鵪鶉MC3R基因的研究未見報道。為此，本研究以MC3R基因?yàn)楹蜻x基因，采用PCR-SSCP及DNA直接測序的方法檢測了朝鮮龍城與中國白羽雜交F1代自鑒別雌雄蛋用群體中該候選基因的單核苷酸多態(tài)性（SNPs），并對多態(tài)位點(diǎn)與鵪鶉屠體性狀之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，以期為鵪鶉分子育種研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中國白羽與朝鮮龍城自別雌雄配套系蛋用鵪鶉238只（母78只，公160只），飼養(yǎng)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)特種經(jīng)濟(jì)動物舍。飼養(yǎng)全程由專人管理，單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)及營養(yǎng)水平一致（雛鶉ME為11.75 MJ·kg-1，CP為23.96%；仔鶉ME為11.49 MJ·kg-1，CP為19.03%；產(chǎn)蛋鶉ME為11.07 MJ·kg-1，CP為19.80%），自由采食。84日齡對鵪鶉進(jìn)行屠宰，同時按照王啟貴等人的報道進(jìn)行屠宰性能的測定[10]。屠宰性能指標(biāo)包括：宰前活重、半凈膛重、全凈膛重、胸肌重、腿肌重、心臟重、肝臟重、腹脂重、肌胃重，并計算相應(yīng)的產(chǎn)率。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥品及基因組DNA提取

克隆載體pMD18-T vector，轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌株JM109（購自Promega公司）；限制性內(nèi)切酶、PCR試劑（購自大連寶生物工程有限公司）；DNA提取試劑（購自天根生物試劑公司）。每只鵪鶉翅靜脈采血，提取鵪鶉血液DNA的方法見文獻(xiàn)[11]，紫外分光光度法測定純度后，稀釋成工作液（50 ng·μL-1），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計

根據(jù)雞MC3R基因序列（Accession No：AB01-7137），采用Oligo primer5.0軟件在編碼區(qū)設(shè)計2對引物，引物序列見表1。引物由北京六合華大基因生物技術(shù)有限公司合成。

表1 MC3R基因引物序列Table 1 Primers to amplify quail MC3R gene

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR體系：擴(kuò)增總體積為25 μL，其中滅菌水16.2 μL、10×buffer2.5 μL、dNTP（10 mmol·L－1）2.0 μL、上下游引物 （10 pmol·L－1）各 1 μL、Taq聚合酶0.3 μL、DNA模板2 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC－200型PCR儀上進(jìn)行。

引物擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，59.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次，72℃延伸8 min，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 PCR－SSCP檢測多態(tài)

PCR產(chǎn)物經(jīng)16%的非變性聚丙烯酰胺凝膠4℃條件下電泳，16 h后進(jìn)行硝酸銀染色，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測。

1.2.5 統(tǒng)計模型的建立

根據(jù)本研究試驗(yàn)群體的特點(diǎn)，構(gòu)建如下線性回歸模型：

Y=μ+G+e

Y為性狀觀察值，μ為群體均數(shù)，G為基因型固定效應(yīng)，e為隨機(jī)效應(yīng)。使用統(tǒng)計軟件SAS8.0檢驗(yàn)基因型與性狀間的相關(guān)程度，并估計性狀的最小二乘均值。

P＜0.05為差異顯著；P＜0.01為差異極顯著；0.05＜P＜0.2為有一定的影響趨勢；P＞0.2為無影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增及SSCP檢測結(jié)果

本文設(shè)計了2對引物對鵪鶉MC3R基因編碼區(qū)部分序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過對相應(yīng)的2個片段的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測，發(fā)現(xiàn)只有引物2的PCR產(chǎn)物存在多態(tài)，故引物1在文中以下部分不作探討。

引物2對蛋用鵪鶉所有個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增片段長度與預(yù)期的片段大小一致（210 bp），且無非特異性擴(kuò)增（見圖1）。鵪鶉所有個體的PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP檢測后，檢測到6 種基因型（AA、BB、CC、AB、BC、AC）（見圖 2）。

圖1 MC3R基因引物2 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of MC3R gene(primer 2)

圖2 MC3R基因引物2 PCR產(chǎn)物的SSCP結(jié)果Fig.2 PCR-SSCP patterns for MC3R gene in primer 2

2.2 多態(tài)性片段的克隆和測序結(jié)果

對經(jīng)SSCP檢測得到的3種純合基因型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序（每個基因型測3次）。序列經(jīng)DNAMAN比對后發(fā)現(xiàn)存在2個突變位點(diǎn)，分別位于所測序列的 27（G→A）和 138（C→T）堿基處。這兩個突變均屬于密碼子同義突變，并沒有影響序列編譯氨基酸的改變。AA基因型的測序結(jié)果已經(jīng)提交到 GenBank上（Accession No：GQ331031），序列比較結(jié)果見圖3。

圖3 三個基因型的序列比較結(jié)果Fig.3 Sequencing blast results of mutational site in layer quail of MC3R gene(primer 2)

2.3 多態(tài)性檢測結(jié)果的分析

2.3.1 MC3R基因該多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率

等位基因頻率是估計和比較遺傳變異的最基本的數(shù)據(jù)。本研究計算該基因A、B、C等位基因在這個群體中的基因型頻率和等位基因頻率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，MC3R基因在該鵪鶉群體中，C等位基因的頻率最高，其次是A等位基因的頻率，B等位基因的頻率最低。CC型的基因型頻率高于AA型的基因型頻率,BB型的基因型頻率最低。

表2 MC3R基因的基因型和等位基因頻率Table 2 Allele frequencies in layer quail of MC3R(primer 2)

2.3.2 MC3R基因與鵪鶉體重的最小二乘分析

對蛋用鵪鶉MC3R基因多態(tài)性與屠宰性狀進(jìn)行最小二乘分析，結(jié)果表明：27（G→A）和138（C→T）突變位點(diǎn)對蛋用鵪鶉的肝臟比率有極顯著的影響（P＜0.01），對肝臟重有顯著影響（P＜0.05），對心臟比率、腹脂重以及腹脂比率有一定的影響（P＜0.2），對其他性狀無影響（P＞0.2），結(jié)果見表3。蛋用鵪鶉AA、BB、CC、AB、BC、AC基因型個體間肝臟重的多重比較結(jié)果表明：BB基因型個體的肝臟重顯著高于AA、AB、BC基因型個體，與CC和AC基因型個體差異不顯著；肝臟比率的多重比較結(jié)果表明：AA基因型個體的肝臟比率顯著高于BB、CC基因型個體，與AB、BC和AC基因型個體差異不顯著，結(jié)果見表3。

表3 MC3R多態(tài)位點(diǎn)對蛋用鵪鶉屠宰性狀的影響Table 3 Effect of MC3R gene polymorphisms on quail carcass trait

續(xù)表

續(xù)表

3 討 論

本研究根據(jù)MC3R基因具有影響和控制體重、生長等屠體性狀的功能[8,12]，開展MC3R基因多態(tài)性對鵪鶉體重影響的相關(guān)研究。通過對蛋用鵪鶉MC3R基因編碼區(qū)的部分序列進(jìn)行PCR－SSCP分析，發(fā)現(xiàn)在該蛋用鵪鶉群體存在兩個SNPs。一般來說，基因外顯子序列相對保守，因?yàn)橥怙@子擔(dān)負(fù)著編碼氨基酸的重要任務(wù)，外顯子突變可能會改變氨基酸序列，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，會影響其編碼產(chǎn)物的生物活性[13]。本研究發(fā)現(xiàn)的兩個突變是同義突變，沒有引起相應(yīng)氨基酸的改變，但是也影響到了鵪鶉的部分屠體性狀。仇雪梅也得到過基因多態(tài)位點(diǎn)的同義突變影響畜禽經(jīng)濟(jì)性狀這樣的結(jié)論[14]，但其作用機(jī)理尚不清楚，還有待于進(jìn)一步研究。

MC3R基因編碼區(qū)2個突變位點(diǎn)導(dǎo)致在此蛋用鵪鶉群體中出現(xiàn)6種基因型，將這6種基因型與鵪鶉屠體性狀進(jìn)行最小二乘分析，結(jié)果表明：突變的BB基因型對鵪鶉肝臟重影響差異顯著；突變的AA基因型肝臟比率顯著高于BB基因型和CC基因型，該結(jié)論表明MC3R基因多態(tài)性顯著影響鵪鶉的部分屠體性狀，這與文獻(xiàn)報道的，關(guān)于雞的MC3R基因多態(tài)性的研究相似。周艷等在濟(jì)寧百日雞、汶上蘆花雞和萊蕪黑雞中，檢測到1個MC3R基因的酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)對活體重、胸肌重有顯著影響，對屠體重、半凈膛重和全凈膛重有一定的影響[15]。結(jié)合該基因的功能和本研究得到的結(jié)果，可以推斷MC3R基因可能對鵪鶉的屠體性狀有影響或者與控制鵪鶉屠體性狀的主效基因相連鎖，可在更多群體中檢測本研究得到的兩個突變位點(diǎn)能否用于鵪鶉屠體性狀的分子標(biāo)記輔助選擇。

在生物學(xué)試驗(yàn)統(tǒng)計中，通常把0.05定義為顯著水平。但有時在對試驗(yàn)要求不太嚴(yán)格或難以獲得較大樣本時，可將標(biāo)準(zhǔn)放寬。本試驗(yàn)中，把小概率P＜0.05定義為因素對指標(biāo)有顯著影響，而把P＜0.2定義為有影響，這樣做的目的是盡可能避免把那些實(shí)際上對目標(biāo)性狀有顯著影響而一次試驗(yàn)未能達(dá)到P＜0.05顯著的基因錯誤地排除掉[16]。該研究結(jié)果有利于探討功能基因的變異對基因表達(dá)調(diào)控及屠體性狀的影響，但本試驗(yàn)的樣本量太小，且試驗(yàn)群體只有1個，更缺乏mRNA及蛋白質(zhì)水平上的證據(jù)，因此，其他大規(guī)模群體的分析驗(yàn)證及應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測mRNA表達(dá)量將是下一步的工作內(nèi)容。

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