反義ATM在體外對喉鱗狀細胞癌ATM蛋白表達影響的研究*

江繼平，馮 俊，唐嗣泉，劉世喜

(1.四川省公安廳，四川 成都 610041;2.川北醫學院附屬醫院耳鼻喉科，四川 南充 637007;3.四川大學華西醫院耳鼻喉咽－頭頸外科，四川 成都 610041)

喉癌是頭頸部原發于上皮的常見惡性腫瘤之一，目前主要治療還是以手術和放射治療為主，放療可以充分保護喉的發聲功能。ATM是與放射敏感性有關的基因，ATM蛋白表達水平差異與細胞放射敏感性程度之間存在一定的關系［1］。本研究中，我們使用反義多核苷酸作用于ATM以研究ATM蛋白表達。

1 材料和方法

1.1 細胞系

人喉鱗狀細胞癌細胞株(Hep-2)由四川大學華西醫院上呼吸道實驗研究中心惠贈。

1.2 試 劑

Lipofectamine 2000、Opti-MEM I、Trizol kit購自美國Carlsbad公司;GAPDH單克隆抗體、SYBR Ex-Script RT-PCR Kit、SYBR Green Master Mix 試劑盒購自Takara公司;ATM單克隆抗體、BCIP/NBT購自美國Santa Cruz公司。

1.3 目標序列的選擇及多核苷酸的合成

于NCBIGenBank查出人ATM序列，設計反義ATM核苷酸(AS:5’-GTACTAGACTCATGGTTCACAATTT-3’);正義ATM 核苷酸(Sen:5’-AAATTGTGAACCATGAGTCTAGTAC-3’);錯配 ATM 核苷酸 (Mis:5’-AAAATGTAAACCATAAGTCTAGAAC-3’)。送上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 多核苷酸轉染喉鱗狀細胞癌細胞

將生長良好的Hep-2約2×105，置于6孔板中培養，待其生長到70－80%時備用。取0.8ug的反義ATM核苷酸、正義ATM核苷酸、錯配ATM核苷酸及Lipofectamine 2000分別加入到Opti-MEM I中，在常溫下作用5分鐘。而后將核苷酸與Lipofectamine 2000在常溫下作用20分鐘后加入Hep-2細胞中，在37℃，5%CO2孵箱中作用。6小時后用PBS洗兩次。最后用 RPMI－1640取代 PBS，在37℃孵箱中過夜備用。

1.5 Western blot分析

收集1.4所述的細胞1×107，以冷 PBS清洗3次，以裂解緩沖液制備細胞總蛋白，總蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，然后轉膜(硝酸纖維素膜 )，用5%的脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜上的蛋白潛在結合位點，加入ATM單克隆抗體(1:100)4℃過夜，GAPDH作為陽性對照，加入二抗后BCIP/NBT試劑顯色、照相。

1.6 統計學處理

采用SPSS 18.0軟件分析。數據以均數±標準差表示，變量資料之間的比較采用秩和檢驗。

2 結 果

將多核苷酸AS、Sen、Mis轉染喉鱗狀細胞癌細胞后，進行Western blot分析，從圖1可以看出AS組蛋白表達明顯較 Sen、Mis、hep-2、lipo(脂質體)組蛋白表達低，從圖2(各組蛋白表達的灰度掃描)可以更準確的得出 AS、Sen、Mis、lipo與 hep-2組(對照組)的蛋白相對表達量以AS-lipo組最低，為48.14±5.53%，用SPSS 18.0軟件分析各組蛋白表達灰度可以得出，AS組與 Sen、Mis、lipo、hep-2 組比較有統計學意義。Sen、Mis、lipo、hep-2組之間比較無統計學意義。

3 討論

喉癌是頭頸部原發于上皮的常見惡性腫瘤之一，其發病率逐漸上升。雖然其診斷和治療手段在過去的30多年已有飛速發展，但其5年生存率卻沒有顯著提高，目前主要治療還是以手術和放射治療為主［2，3］。放療可以充分保護喉作為發聲器官的重要生理功能、減少手術范圍和創傷，有其特有的優越性。然而由于喉鱗癌細胞對射線的抗拒能力，導致放射敏感性降低，影響了治療效果［4］。

許多因素決定著細胞對放射線的反應，其中細胞的DNA損傷修復能力及細胞周期調控是細胞放射敏感性的主要決定因素［5］。而ATM基因在DSB損傷修復及細胞周期調控的信號傳導中扮演著極其重要的作用，因此成為腫瘤放射增敏的一個重要靶基因［6］共濟失調毛細血管擴張癥(ataxia－telangiectasia，AT)是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，以進行性中樞神經元變性免疫缺陷和對放射線敏感為特點，由于AT患者這種特殊的遺傳性的輻射敏感性，使得其致病基因(ataxia－telangiectasia mutant，ATM)已成為放射生物學界研究輻射敏感性機制的重要對象之一。因此，我們用反義ATM作用于喉鱗狀細胞癌細胞(Hep－2)后，對其ATM蛋白表達進行檢測，探討 ATM蛋白表達水平與喉癌細胞株間放射敏感性差異的關系，以期為進一步了解臨床喉癌放射生物學特征提供實驗依據。從Western blot分析，將多核苷酸AS轉染喉鱗狀細胞癌細胞，與轉染Sen、Mis、lipo相比，其蛋白表達量最低，僅為對照組(hep-2組)的(48.14±5.53)%，故反義 ATM核苷酸(AS)能有效抑制喉鱗狀細胞癌細胞中ATM蛋白的表達。已有研究表明，ATM蛋白表達水平差異與細胞放射敏感性程度之間存在一定的關系［1］。Zou Jian等［7］用脂質體將反義ATM導入頭頸鱗癌細胞系SCCVII中，轉染24小時后ATM蛋白表達量減少，與轉入無關序列相比，轉染反義ATM的SCCVII細胞在輻照后表現出內在放射敏感性增強。實驗中我們用反義ATM使喉鱗狀細胞癌細胞中ATM蛋白的表達降低，故我們推測其亦有可能使喉鱗狀細胞癌細胞對放射治療的敏感性增強，進而可能為喉癌的非手術治療，保留喉的發聲功能、提高喉癌病人的生存質量成為可能。

［1］LEI L，MICHAEL S，RANDY JL.Cellular responses to ionizing radiation damage ［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2001，(49):1157－1162

［2］Akman FC，Dag N，Ataman OU，et al.The impact of treatment center on the outcome of patients with laryngeal cancer treated with surgery and radiotherapy［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2008，265(10):1245－1255

［3］Smith RB.Surgery in the management of laryngeal and hypopharyngeal carcinoma［J］.International journal of radiation oncology，2007，69(2 Suppl):28－30

［4］Hristov B，Bajaj GK.Radiotherapeutic management of laryngeal carcinoma［J］.Otolaryngologic clinics of North America，2008，41(4):715－740

［5］Rodemann HP，Blaese MA.Responses of normal cells to ionizing radiation［J］.Seminars in radiation oncology ，2007，17(2):81 －88

［6］Choi EK，Ji IM，Lee SR，et al.Radiosensitization of tumor cells by modulation of ATM kinase［J］.International journal of radiation biology，2006，82(4):277－283

［7］Zou Jian，Qiao Xiaoming，Ye Huiping，et al.Antisense inhibition of ATM gene enhances the radiosensitivity of head and neck squamous cell carcinoma in mice［J］.Journal of Experimental＆ Clinical Cancer Research，2008，(27):56