丹參酮對血瘀證乳腺癌 P53基因、mdm2基因表達的影響*

劉永惠 郭少賢 常 靖 李 安 夏欣欣 王 瑞 華 莎

西安交通大學醫學院第一附屬醫院(西安 710061)

乳腺癌的發生、發展、轉移與突變型 P53基因和 mdm2基因關系密切,突變型 P53基因和 mdm2基因是腫瘤的相關基因。現代中醫研究認為,腫瘤及其轉移存在血瘀證,血瘀證與腫瘤增殖、轉移存在正相關關系[1]。為深入研究血瘀證與活血化瘀藥物抗癌的作用機理,本實驗通過檢測丹參酮干預血瘀證裸鼠 P53、mdm2的表達,探討其抗腫瘤增殖、轉移的作用機理。

1 材料與方法 1.1 實驗動物與細胞系 雌性裸鼠 40只,5周齡,體重 (20± 1)g,來自上海斯萊克實驗動物有限責任公司 ,許可證號碼 SCXK(滬 2007-0005),實驗和飼養均在 SPF條件下進行。乳腺癌細胞株 MDA-M B-231s購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 實驗藥物 丹參酮注射液購自西安交通大學醫學院第一附屬醫院 (批號 90527CY)。腎上腺素購自上海禾豐制藥有限公司(批號 H31021062)。

1.3 主要儀器與試劑 SCW-BCM生物超凈工作臺購自蘇州市長春電子儀器廠,MDF-U72V超低溫冰箱購自日本三洋公司,臺式多功能離心機購自長沙市鑫奧儀器儀表有限公司,普通光學顯微鏡購自日本 Olympus公司,電熱恒溫水浴箱DR-HW-2購自北京西城區醫療器械廠,CO2細胞培養箱購自上海控菱科技有限公司,旋渦混合器購自上海第三分析儀器廠,胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司,P53 Elisa試劑盒購自 Groundwork Biotechnology Diagnosticate分裝,MdM 2 Elisa試劑盒購自 Groundwork Biotechnology Diagnosticate分裝。

1.4 方 法 1.4.1 細胞培養:人乳腺癌細胞系 MDAM B-231s在 10%胎牛血清的培養基中,5%CO2、37℃條件下培養,待細胞長至瓶底 80～90%,用 0.25%胰蛋白酶消化,3～5d傳代一次。取對數生長期的細胞進行接種。

1.4.2 血瘀模型:將雌性裸鼠隨機分 2大組,分別為血瘀組、空白組。空白組 10只,連續 7d每只裸鼠皮下注射 0.2mL生理鹽水。血瘀組 30只,連續 7d每只裸鼠皮下注射 0.01%腎上腺素 0.2mL[2]。

1.4.3 測定指標與方法:血瘀組中隨機選取 10只裸鼠和空白組 10只裸鼠,均采用摘除眼球取血法。由于裸鼠的血量較少且標本量不得低于 4mL,所以把同一組 2只裸鼠的血樣合并為 1個樣本 ,每組 5個樣本 ,取血后立即用肝素抗凝,送至西安交通大學第一附屬醫院檢驗科進行測定。在血液流變儀上,切變率為 1s-1、5s-1、30s-1、200s-1測定全血黏度。

1.4.4 接種與給藥:將血瘀組余下的 20只裸鼠,隨機分為血瘀加瘤組和丹參酮組,每組 10只。將已培養的人乳腺癌細胞 M DA-MB-231s細胞懸液 0.2mL(1×10 7個)接種于裸鼠背部的外上方皮下。給藥計量采用人與動物計量換算法確定。①血瘀加瘤組:每天生理鹽水 0.2mL灌胃,連續給藥 14d。②丹參酮組:丹參酮給予 2mgㄍkg灌胃,連續給藥 14d。

1.4.5 蛋白酶聯免疫檢測 (ELISA)P53、mdm2,第 15天,每只裸鼠眼球采血 2mL,靜置 20min,然后 3000轉/分離心20min,仔細收集上清,貯存在-20℃冰箱中待檢。實驗步驟嚴格按試劑盒使用說明書操作 ,分別檢測裸鼠血清 P53、mdm2蛋白的含量。

1.5 統計學分析 實驗數據以均數±標準差表示,兩組間數據的比較采用 t檢驗。 P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果 2.1 血液流變學 血液流變學檢測結果見表1。

表1 血液流變學結果(±s)

表1 血液流變學結果(±s)

指標 空白組 血瘀組1S-1 28.43± 7.28 45.35± 10.56 5S-1 8.76± 2.31 13.54± 3.24 30S-1 3.53± 1.23 5.11± 3.36 200S-1 2.19± 1.24 3.99± 1.57

經 t檢驗后,認為空白組與血瘀組在 1S-1、5S-1、30S-1、200S-1四個指標間差別均有統計學意義(P＜0.05),可以認為兩組的全血黏度有差異。

2.2 P53、mdm2在血瘀加瘤組、丹參酮組中的表達情況

檢測 P53、mdm2在血瘀加瘤組、丹參酮組中的表達情況見表2。

表2 P53和 mdm2檢測結果(±s)

表2 P53和 mdm2檢測結果(±s)

指標 血瘀加瘤組(ug/ml) 丹參酮組(ug/ml)P53 27.5213± 1.80803 19.0113± 1.06372 Mdm2 11.5725± 0.94633 5.6913± 1.30987

經 t檢驗后,認為丹參酮組與血瘀加瘤組比較差別均有統計學意義(P＜0.05),可認為兩組有差異。

3 討 論 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發病率較高,并出現逐年上升、發病年齡年輕化的趨勢。據統計,每年新增乳腺癌的患者已超過 100萬[3],近年來,在我國乳腺癌已成為婦女惡性腫瘤第一位[4]。祖國醫學認為乳腺癌為“乳巖”、“乳石癰”、“妒乳”。血脈瘀阻是其發病的主要機制 ,又是其形成的病理結果。臨床以病理性腫塊、疼痛、舌質青紫為特點[5],正如《圣濟總錄》指出“瘤之為義,留滯而不去也。氣血流行不失其常,則形體和平;或余贅及郁結壅塞,則乘虛投隙,瘤所以生。”研究表明腎上腺素多次小劑量皮下注射模擬長期肝氣不疏,氣滯不能行血,導致裸鼠全血黏度增高,血液處于黏、稠狀態 ,形成血瘀證[2]當血漿黏度增高時,血流速度隨之減緩,血流中的腫瘤細胞由于其體積較小,根據流體力學的原理,體積較小的腫瘤細胞就從血管軸心處向血管壁移動而易于附著血管壁不規則的地方,或附著于貼壁血栓上,或進入停滯于血管壁的湍流區內而使轉移的腫瘤細胞得以著床,有利于腫瘤生長、浸潤和轉移。腫瘤形成后加劇了血脈瘀阻。血瘀證與腫瘤生長轉移存在正相關關系。

野生型 P53基因是一個重要的抑癌基因,位于 17號染色體短臂 1區 3.1帶 (17pl3.1)上,由 11個外顯子、10個內含子組成,編碼 393個氨基酸組成的 53KD的核內磷酸化蛋白。野生型 P53蛋白極不穩定,半衰期非常短,大約 20min左右 ,具有反式激活功能和廣譜的腫瘤抑制作用。但野生型 P53基因卻是人類腫瘤發生最常見的突變基因之一。近 50%的人類腫瘤發現有 P53突變,人類乳腺癌中 P53的突變率為 50%～70%。其突變方式有點突變、插入突變、缺失突變、移碼突變等。突變型P53基因編碼的 P53蛋白的半衰期可達數小時之久,突變體能夠與野生型蛋白形成異四聚體。異四聚體的構象使它們處于顯性抑制狀態,即結構正常卻失去野生型 P53蛋白的正常功能,失去了細胞周期監控器,引起細胞的增殖,最終會導致細胞癌變;并且可以抑制 P53的降解,導致細胞核內突變蛋白的積聚。一些分裂增殖的腫瘤細胞,可逃避免疫攻擊向周邊浸潤,進入血液循環,并向遠處轉移,積聚的 P53蛋白可隨腫瘤細胞的自溶或胞吐作用釋放到胞外,進入血液循環。故認為 P53可以作為腫瘤的一種特異性標志物應用于疾病的早期診斷和預后評估中。

mdm2基因即小鼠雙微體基因,是一種原癌基因 ,位于 12號染色體長臂 (12q13～14)上,編碼 491個氨基酸組成的核內酸性蛋白質,對細胞生長具有調節作用,具有延長細胞生存期、促細胞增生的作用。近年來國內外研究發現,mdm2在體內是通過調節 P53的穩定性而影響細胞的狀態,這兩者之間存在著一種負反饋調節環即 mdm2-P53負反饋調節環[6],它與腫瘤發生、發展及轉移有密切關系。 P53-mdm2負反饋調節環 ,在正常狀態下,mdm2抑制野生型 P53激活轉錄作用且介導 P53降解;mdm2的表達又受野生型 P53的調節,這對于維持正常細胞的生長有重要意義,是機體維持正常生理功能所必須的調節機制[7]。可一但 P53和 mdm2出現異常表達 ,mdm2表達過強可封閉 P53介導的反式激活作用,使 P53功能喪失,細胞周期發生紊亂,致使細胞異常的增多,產生瘤體[8]。

活血化瘀藥物丹參等在我們既往臨床與實驗研究中發現有抗腫瘤的作用[9],并對腫瘤轉移微環境也有重要的改善作用[10]。本實驗選取丹參的提取物丹參酮,干預乳腺癌突變型P53基因、mdm2基因的表達,經蛋白酶聯免疫法檢測發現丹參酮能有效的抑制突變型 P53和 mdm2的表達。這說明丹參酮可以降低血液粘度,改善微循環[11],緩解血瘀證狀態,有利于機體發揮免疫監視作用,并且通過拮抗突變作用,可以降低突變型P53和 mdm2表達,從而發揮抑制腫瘤的作用。目前丹參酮能抑制腫瘤的突變型 P53基因、mdm2基因的表達文獻報道較少,故本研究結論揭示血瘀證與腫瘤的突變型 P53基因、mdm2基因存在著密切關系,同時證實丹參酮在抑制腫瘤生長、轉移中具有重要作用。

[1]劉永惠,楊曉峰,周冬枝.腫瘤轉移與血瘀證的臨床研究[J].中國中醫基礎醫學雜志,2002,8(4):50-52.

[2]和 嵐 ,蔣文躍,毛騰敏.注射腎上腺素模擬“氣滯”復制急、慢性血瘀模型初探[J].中國中西醫結合雜志,2004,24(3):244-245.

[3]Westeel V,Depierre A.Combined modality treatment ofBreast Cancer.Am[J].Respir Med,2003,2:477-490.

[4]李國利,劉 惠,程 建.乳腺癌鈣化點的計算機輔助診斷[J].生物醫學工程學志,2011,28(1):171-173.

[5]趙新漢,張曉智.《腫瘤多學科綜合治療》[M].西安:第四軍醫大學出版社,2008:282-285.

[6]鄭志明.Seladin-1、P53、Mdm2在垂體腺瘤中的表達及調控機制[D].山東大學,2008:10-20.

[7]VargasD,Ronai Z.p53-Mdm2the affair that never ends[J].Carcinogenesis,2002,23(4):186.

[8]闞和平 ,劉正軍,譚永法.胰腺癌 P53蛋白表達與AgNORs量及組織學分級的關系[J].中國病理生理雜志,2008,24(8):1521-1523.

[9]劉永惠,鄧景元,鄒 鵬.張玉五教授治療腫瘤學術思想探討[J].河北中醫藥學報,2006,21(4):31-33.

[10]郭少賢,劉永惠,常 靖.麝香酮干預血瘀證乳腺癌組織血管生成相關因子表達研究[J].河北中醫藥學報,2011,26(2):40-41.

[11]張國榮.活血化瘀法治療惡性腫瘤作用機制探討[J].山西中醫,2010,26(5):61.