基于 PLS虛寒證大鼠模型表征評價體系的研究*

韓冰冰 王世軍 趙海軍 山東中醫藥大學基礎醫學院(濟南 250355)

建立規范的動物模型評價體系是中醫證候動物模型研究的重要環節。寒證是基本的中醫證候類型,作為中醫證候研究的重要切入點,具有寒證共性的中醫證候模型的創建與評價一直受到關注。本實驗采用中藥復方復制動物模型,采用 PLS法對模型表征進行評價分析,以期建立符合中醫理論的動物模型及評價體系。

1 材料與方法 1.1 實驗動物 SPF級 Wistar大鼠,30只 ,體重 200±20g,雌雄各半 ,由山東魯抗醫藥集團提供 ,動物生產許可證號:SCXK(魯)20080002。

1.2 實驗儀器 M C-142L型電子體溫計,歐姆龍大連有限公司;DT-880B型手持式紅外人體表面溫度快速篩檢儀,深圳市華盛昌機械實業有限公司;H-ZYC-1型四通道自主活動儀,淮北正華生物儀器公司;XRY-1A型數顯氧彈熱量計,上海昌吉地質儀器有限公司。

1.3 藥物及試劑 生石膏產于湖北應城,知母產于河北易縣,黃柏產于四川滎經,龍膽草產于吉林臨江,均經山東中醫藥大學李峰教授鑒定。苯甲酸(國家標準物質),中國計量科學研究院 ,批號:200903。

1.4 造模方法與分組 實驗動物隨機分為空白對照組(10只)、虛寒組 (20只 )。虛寒組用生石膏、龍膽草、黃柏和知母,按照 2∶1.2∶1∶ 1.5比例,制成 4g/mL水煎劑,灌胃 1.6mL/100g,每天 1次 ,連續 14d。

1.5 指標檢測 1.5.1 一般狀況:仔細觀察各組動物的活動狀態、毛發潔凈度、毛發疏密度、毛發光澤、爪色、耳色、舌色等情況,計入一般狀況表。

1.5.2 肛溫:晚 18時開始測量:將涂有凡士林的測溫探頭插入直腸約 3cm,測溫計顯示數字穩定蜂鳴音提示后讀取數字。

1.5.3 趾溫:使用紅外體溫儀檢測大鼠趾溫。

1.5.4 寒熱趨向:使用自制寒熱趨向行為測定儀檢測大鼠寒熱趨向。事先預熱預冷,將寒、熱箱溫度分別控制在低于室溫 3℃和高于室溫 3℃(室溫 24℃左右)。測試時 ,將大鼠置于大鼠常溫箱 3次,記錄大鼠進寒熱箱的次數。

1.5.5 自主活動:采用開場實驗法,使用自主活動儀記錄各組大鼠 5min自主活動次數。

1.5.6 攝食量、飲水量、糞便、尿液:上午 8點將大鼠放入代謝籠,觀察并記錄其 24h攝食量、飲水量、尿液 (量、色、質)、糞便 (量、色、質 )。

1.5.7 單位體重攝入能、糞便能、消化能、可代謝能:將大鼠放入代謝籠,每籠 1只,觀察并收集其 24h糞便,置 65℃電熱鼓風干燥箱干燥至恒重,稱重(精確至 0.001g)。使用 XRY-1A數顯氧彈熱量計檢測飼料及實驗動物的糞便熱值。分別計算其攝入能、糞便能、消化能、可代謝能等能量代謝指標(隨尿損失的能量按消化能的 2%計算)。具體公式如下:

攝入能(kJ/d)=攝入干物質量(g/d)×食物熱值 (kJ/g);

糞便能(kJ/d)=糞便干重(g/d)×糞便熱值 (kJ/g);

消化能(kJ/d)=攝入能(kJ/d)-糞便能(kJ/d);

可代謝能 (kJ/d)=消化能(kJ/d)-尿(kJ/d)=消化能(kJ/d)×98%

以上指標分別除以體重即單位體重攝入能、糞便能、消化能、可代謝能。

1.6 統計學方法 采用 Tanagra1.4進行偏最小二乘回歸(PLS)數據分析。

2 結 果 2.1 實驗數據處理 實驗數據進行標準化處理,自變量表見表 1。

表1 虛寒證模型指標變量標識表

2.2 虛寒證 PLS回歸模型 建立虛寒證 PLS回歸模型,表達式如下:

y=3.178514+ 0.055077X1-0.003064X2+0.000141X3-0.050202X4-0.09268X5-0.000358X6-0.023644X7+ 0.020232X8+0.140244X9+ 0.038486X10+ 0.053456X11-0.091105X12+ 0.133617X13+ 0.005275X14+ 0.002452X15-0.010199X16+ 0.08835X17+ 0.003022X18-0.048857X19+0.119771X20

與虛寒證模型呈 正相關的變量有:X1、X3、X8、X9、X10、X11、X13、X14、X15、X20,與虛寒證模型呈負相關的變量有:X2、X4、X5、X6、X7、X12、X16、X17、X18、X19。

2.3 VIP變量投影重要性指標 變量投影重要性指標用來描述自變量對因變量的解釋能力 ,VIP值越大,自變量 x對 y的解釋能力越強,見圖 1。

圖1 虛寒證模型的V IP直方圖

如圖所示,對虛寒模型與空白比模型有重要貢獻(解釋能力 )的指標有:X20(1.9258)、X9(1.6881)、X17(1.5394)、X2(1.3964)、X5(1.3576)、X6(1.2253)、X14(1.1664)、X18(1.0635),VIP值均大于 1。

2.4 模型散點分布圖 見圖 2。

圖2 虛寒證模型散點分布圖

如圖所示,虛寒組和空白對照組樣本點完全分離,兩組組之間未見任何交叉與重疊,得到了明顯區分,證明造模成功。模型評價回代判別正確率 100%,用留-法交叉驗證判別正確率80.77%。

2.5 模型得分見表 2。

表2 虛寒證大鼠模型評價分值

3 討 論 自 1978年起北京醫科大學梁月華等根據中醫理論“寒涼藥易傷陽氣,陽虛則寒”開始探索給大鼠長期大量服用寒涼藥復制虛寒證動物模型[1]。在此基礎上,梁氏進行了大量基礎研究[2,3],對虛寒證大鼠的神經、內分泌、免疫等多系統多項指標進行檢測,結果證明寒涼藥使交感神經一腎上腺(皮質、髓質)系統機能活動減弱,代謝降低,此結果與臨床所觀察的寒證、熱證患者的表現一致。另外,梁氏還采用藥物反證,發現溫補方藥對虛寒證大鼠神經內分泌方面也均有調整作用[4]。在梁氏基礎上,陳小野等又進行了深入的探索。陳氏認為[5],梁氏的虛寒證和虛熱證動物模型在寒證和熱證上基本得到公認,但存在兩個環節的不足:一是可能未能在寒、熱證的基礎上達到寒邪傷陽而致虛,熱邪傷陰而致虛;二是在虛證上未達到“精氣奪則虛”。陳氏認為,如造模時間或造模強度不足,虛證階段仍有可能不能達到。因此嘗試通過加大造模量改進這一模型并進行了大量指標的檢測[6],證實該模型有程度較深的證候表現,并出現虛證,同時指出生物學特性的相關性同樣為機體的重要生理病理特征,應引起重視。

本實驗造模方藥選自陳氏復方,用生石膏、龍膽草、黃柏和知母,按照 2:1.2:1:1.5比例,制成 4g/mL水煎劑,灌胃 4mL/d。造模藥量比梁氏用量大幅度增加,預實驗用藥兩周左右時發現動物開始出現少量死亡,并隨時間延長死亡數量逐漸上升,提示耐受達到極限,因此確定造模時間為 14d。

模型復制結束后,進行模型表征的檢測,并采用 PLS數據分析進行模型評價,PLS是一種新興的統計方法,它集多元線性回歸、典型相關分析和主成分分析的基本功能為一體,將建模預測類型的數據分析方法與非模型式的數據認識方法有機地結合起來,因此,偏最小二乘回歸較傳統的回歸分析、主成分分析具有更大優勢,能較好地處理基于傳統最小二乘回歸方法難以解決的問題,在處理樣本容量小、自變量多、變量間存在嚴重多重相關性問題方面具有獨特的優勢,從而使模型精度、穩健性、實用性得到提高。

PLS模型顯示虛寒組和空白對照組樣本點完全分離,得到明顯區分,對虛寒模型有重要貢獻 (解釋能力)的指標有:糞質地、毛發潔凈度、尿色、體重、平均趾溫、自主活動、飲水量、尿質地。其中糞質地、毛發潔凈度、飲水量與模型呈正相關,體重、尿色、尿質地、平均趾溫、自主活動與模型呈負相關。 PLS數據分析證實大便溏稀,毛發污穢,飲水量多,體重減輕,趾端溫度低,活動量少為虛寒證模型動物的主要癥狀及體征。這與虛寒證的臨床診斷基本相符,體現了虛寒證“陽虛內寒”的病理特點。本實驗采用 PLS法建立了虛寒證模型的表征評價體系,這對于豐富與完善虛寒證動物模型的評價標準,推動中醫證候動物模型的規范化進程,具有積極的科學意義和廣闊的應用前景。

[1]梁月華,王 晶,謝竹藩.寒涼藥與溫熱藥對交感神經腎上腺及代謝機能的影響[J].北京大學學報(醫學版),1987,19(1):54-57.

[2]楊 勇,梁月華,汪長中,等.虛寒、虛熱證大鼠神經、內分泌、免疫與血液流變學的時相性研究[J].中國中醫基礎醫學雜志,2002,8(2):109-112.

[3]李 良,劉國貞,梁月華.虛寒證鼠服溫熱藥后腦、垂體和腎上腺內 5-羥色胺及去甲腎上腺素神經元和神經纖維的變化[J].中醫雜志,2000,41(10):623-626.

[4]宋 輝,梁月華.溫陽和補氣藥對虛寒證大鼠神經內分泌的影響[J].中國中藥雜志,1997,22(3):182-186.

[5]陳小野,周永生,樊雅莉,等.大鼠虛寒證模型的研制[J].中國實驗動物學報,2001,9(3):155-158.

[6]樊雅莉,張宇鵬,蔣小麗,等.大鼠虛寒證模型部分指標相關性的初步研究[J].實驗動物科學與管理,2003,20(1):4-7.