鹽酸法舒地爾對大鼠癲癇持續狀態海馬神經元的保護作用

耿 瑜，鄭輯英，李光來，薛國芳，郝慶偉

癲癇持續狀態（SE）是指連續癲癇發作持續30min或者在其兩次或者多次發作的間歇期意識沒有完全恢復的狀態。SE有很高的致殘率和致死率，探索新的更加有效的SE后神經元保護方法有著重要臨床意義。鹽酸法舒地爾是一種異喹啉磺胺衍生物，主要是通過抑制Rho激酶發揮作用，具有擴張血管、改善腦循環、減輕缺血損傷的作用。本實驗旨在觀察SE后大鼠腦組織凋亡相關基因XIAP、Caspase－9的表達情況，探討鹽酸法舒地爾干預對SE導致的神經元損傷的影響及其可能的機制，以期為鹽酸法舒地爾應用于臨床SE的治療提供可能的動物實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年Wistar大鼠54只，體重220g～240 g（山西醫科大學實驗動物中心提供），氯化鋰（中國醫藥集團上海制劑公司），匹羅卡品（美國Sigma公司），免疫組化試劑盒、DAB顯色劑及多聚賴氨酸、Caspase－9一抗（BA2216）、XIAP一抗（BA2621，武漢博士德生物有限公司），鹽酸法舒地爾（天津紅日醫藥有限公司）。

1.2 動物分組及模型的建立 Wistar大鼠隨機分為對照組（A組）、模型組（B組）、鹽酸法舒地爾組（C組）。后兩組再隨機分為4個亞組：分別用于SE后6h、12h、24h和48h時點。采用國內外公認的氯化鋰－匹羅卡品癲癇持續狀態動物模型：按體重127mg/kg，18h后經腹腔注射新鮮配制的匹羅卡品30mg/kg。造模成功后所有大鼠隨機分為模型組、鹽酸法舒地爾組。鹽酸法舒地爾組于達癲癇持續狀態1h后采用腹腔注射給藥50mg/kg，模型組和對照組1h后腹腔注射等量生理鹽水。驚厥評分采用Racine評分法，癇性發作行為分級6級。癇性發作持續超過30 min為SE。在SE達1h時，予腹腔注射地西泮10mg/kg，終止癇性發作。

1.3 標本處理 在SE后相應時間點各取大鼠6只，用25%烏拉坦4mL/kg深麻醉后，斷頭取腦，大鼠腦組織置入4%多聚甲醛中固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋后，在視交叉后海馬區連續冠狀切片，每片厚5μm。HE染色，光鏡下觀察形態學變化。

1.4 細胞凋亡檢測 采用原位缺口末端標記法（TUNEL法）檢測，按試劑盒（POD）提供方法操作，細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞計數5個高倍視野下的凋亡細胞數，凋亡指數（apoptosis index，AI）以凋亡細胞/100個細胞表示。

1.5 免疫組化檢測 采用SP法，染色步驟按試劑盒說明書進行。顯微鏡下胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽性細胞，每只動物隨機取3張切片，每張切片在400倍視野下隨機選取不重疊的5個視野，圖像輸入計算機，采用彩色圖像分析系統，分別計數XIAP和Caspase－9染色陽性細胞數，取均數。

2 結 果

2.1 行為學表現 B組大鼠注射匹羅卡品后15min～30min均出現流涎、點頭、洗臉樣動作；隨后出現前肢陣攣，之后很快表現為前肢陣攣伴站立，進一步發展到全身強直陣攣發作伴站立、摔倒，反復發作，均達到Ⅳ級～Ⅴ級發作，呈癲癇持續狀態，點燃率為100%。C組大鼠也均達到癲癇持續狀態，但潛伏期較長且癇性發作程度較B組輕，多在Ⅲ級～Ⅳ級發作。A組大鼠無癲癇發作。

2.2 TUNEL檢測結果 A組僅有少量TUNEL陽性細胞表達，呈散在分布，著色較淺。B組6hTUNEL陽性細胞表達開始增多，并隨時間點的延長而增加，24h達高峰，48h減少，與B組相比，C組TUNEL陽性細胞也是在24h達高峰，但相應時間點TUNEL陽性細胞的表達均低于B組（P＜0.0 5或P＜0.01）。詳見表1。

表1 3組大鼠SE后海馬TUNEL陽性細胞數（±s）

表1 3組大鼠SE后海馬TUNEL陽性細胞數（±s）

組別6h 12h 24h 48h A組1.87±0.26 B組 14.93±1.03 28.53±1.37 36.61±1.38 28.35±1.20 C組 13.30±1.22 17.66±1.16 27.49±1.34 19.83±1.12 P＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 AP和Caspase－9檢測 A組大鼠海馬未見XIAP和Caspase－9陽性細胞出現。B組6h有大量XIAP和Caspase－9陽性細胞出現，12h到達高峰；C組與B組相比，各時間點XIAP陽性細胞數均顯著增加（P＜0.05），Caspase－9陽性細胞數均顯著減少（P＜0.05）。詳見表2、表3。

表2 B組與C組大鼠SE后海馬XIAP陽性細胞數（±s）

表2 B組與C組大鼠SE后海馬XIAP陽性細胞數（±s）

組別6h 12h 24h 48h B組 13.28±6.47 22.12±7.25 15.97±8.12 10.51±4.31 C組 24.51±9.07 39.30±12.94 22.77±12.23 19.99±4.42 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表3 3組大鼠SE后海馬Caspase－9陽性細胞數（±s）

表3 3組大鼠SE后海馬Caspase－9陽性細胞數（±s）

組別6h 12h 24h 48h B 組 34.92±10.77 54.01±14.11 41.35±10.59 38.85±9.76 C組 20.58±7.53 36.37±12.57 28.07±7.37 20.13±9.08 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討 論

目前認為至少有三條信號通路參與細胞的凋亡：線粒體通路、死亡受體通路、內皮網通路。Caspase是細胞凋亡的核心，在這三條凋亡通路中幾乎涉及Caspase的級聯反應［1］。凋亡過程可劃分為啟動、效應、降解3個功能截然不同的階段，而Caspase－9是最主要的凋亡啟動分子，是線粒體凋亡途徑的關鍵蛋白酶，處于Caspase“瀑布式”的頂端，它可以啟動Caspase的級聯反應，并激活下游的Caspase－3，從而完成對其相應底物的切割，引起細胞凋亡［2］。

XIAP是一種細胞內源性的抗凋亡蛋白，屬于凋亡抑制蛋白家族（IAPs）。而XIAP是該家族中結構最典型、作用最強、功能最全面的Caspase抑制因子。它含有三個結構域：BIR、RING和CARD，其中特征性功能結構為氨基端的3個BIR結構域：BIR1、BIR2和BIR3。XIAP主要通過BIR3結構域與Caspase－9單體相結合，形成異源性二聚體，使Caspase－9失去單體結構而喪失其催化活性，當BIR3結構域發生突變后，XIAP將會失去對Caspase－9的抑制作用。

鹽酸法舒地爾是一種Rho激酶（ROCK）特異性抑制劑，起初認為其僅是一種細胞內鈣離子拮抗劑，可以抑制蛋白激酶A/C/G和肌球蛋白輕鏈激酶，從而使血管平滑肌舒張、血管擴張［3］。腦缺血后缺血神經元軸突內ROCK蛋白表達增加、活性增強［4－6］，鹽酸法舒地爾不僅可以通過以上的作用機制來緩解腦缺血癥狀，還可以通過直接作用于受損的神經元而發揮神經元保護作用。本實驗研究表明，預先給予鹽酸法舒地爾不僅能延遲SE出現的時間，并且能減輕癲癇發作級別以及神經元的損傷程度；鹽酸法舒地爾可能是通過上調SE大鼠腦組織XIAP的表達而抑制Caspase－9產生，從而發揮神經元保護作用。

［1］ Thornberry NA，Lazebnik Y.Caspases：Enemies within［J］.Science，1998，281（5381）：1312－1316.

［2］ Fujita E，Egashira J，Urase K，etal.Caspase－9processing by caspase－3via a feedback amplification loop in vivo［J］.Cell Death Differ，2001，8（4）：335－344.

［3］ Masahiro T，Hiroshi N，Hideo Y，etal.Development of specific Rho－kinase inhibitors and their clinical application［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2005，1754：245－252.

［4］ Yano K，Kawasaki K，Hattori T，etal.Demonstration of elevation and localization of Rho－kinase activity in the brain of a rat model of cerebral infarction［J］.Eur J Pharmacol，2008，594（1－3）：77－83.

［5］ Yamashita K，Kotani Y，Nakajima Y，etal.Fasudil，a Rho kinase（ROCK）inhibitor，protects against ischemic neuronal damage in vitro and in vivo by acting directly on neurons［J］.Brain Res，2007，1154：215－224.

［6］ Huang L，Li Q，Li H，etal.Inhibition of intracellular Ca2＋release by a Rho－kinase inhibitor for the treatment of ischemic damage in primary cultured rat hippocampal neurons［J］.Eur J Pharmacol，2009，602（2－3）：238－244.