益氣養陰活血方對病毒性擴張型心肌病小鼠TNF－αmRNA表達的影響1）

安 靜，陳會君

本研究根據慢性心肌炎及早期擴張型心肌?。―CM）患者之氣陰兩虛、瘀血阻滯、熱毒殘留的癥候特點。觀察益氣養陰活血方對小鼠心肌組織病理形態學變化及心肌組織腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的影響，初步揭示作用機制，為中醫藥早期治療DCM提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 210只雄性Balb／c小鼠，體重10g，3周～4周齡，由北京軍事醫學科學院實驗動物中心提供。分籠飼養，每籠10只室溫（26±3）℃，均食用普通飼料。

1.2 病毒 柯薩奇B3m（CVB3m）病毒（Nancy株，購自哈爾濱醫科大學克山病研究所），在Hela細胞中傳代，凍融3次，離心（2 000r／min，10min），上清液分裝，在 Hela細胞中測50%組織感染率（TCID50）為10－7，－70℃保存備用。

1.3 實驗用藥 益氣養陰活血組方：黃芪、紅參、生地、麥冬、五味子、川芎、丹參、蘭根、大青葉、桔梗、升麻、遠志、柏子仁、合歡皮。中藥經水提取，制成浸膏，含水量為21%。用蒸餾水稀釋，調整濃度為82%，即相當于每毫升懸液中含生藥4.3g備用。黑龍江中醫藥大學制劑室提供。生產日期：20051108。

1.4 主要試劑 試劑盒TrizolRNAIsolation、反轉錄試劑盒由美國Invitrogen公司提供、TaqDNA聚合酶由大連寶生物有限公司提供。PCR Marker試劑盒由美國Promega公司提供。PCR引物，應用引物設計軟件Primer5.0設計引物，上海捷倍思基因有限公司合成。詳見表1。

表1 PCR引物序列

1.5 模型制備及分組 3周～4周齡雄性Balb／c小鼠共210只，自然光線，自由飲水，自由攝食條件下適應性喂養1周。1周后，其中180只Balb／c小鼠隨機分為4組：正常對照組、模型組，中藥高、低劑量組。正常對照組30只，模型組，中藥高、低劑量組各60只。中藥高劑量組、中藥低劑量組、模型對照組均于實驗的1d、8d、15d、22d、36d、50d分別予腹腔注射 RM1640液稀釋的0.1mL10－4TCID50CVB3m、0.1mL 10－3TCID50CVB3m、0.2 mL10－3TCID50CVB3m、0.1mL10－3TCID50CVB3m、0.1 mL10－4TCID50CVB3m、0.1mL10－4TCID50CVB3m。正常對照組分別于實驗同期注射同體積的RM1640液。

1.6 給藥方法 各組均于末次病毒注射后10d，即實驗的第60天開始灌胃。中藥低、高劑量組均給予益氣養陰活血方混懸液灌胃，劑量分別為10.35g／（kg·d）及20.7g／（kg·d），以上給藥劑量均為生藥量。模型對照組和正常對照組灌以同體積蒸餾水。每日1次灌胃，連續4周。

1.7 取材 稱重后將小鼠用頸椎脫臼的方式處死，置入盛70%乙醇的燒杯中，使其體毛完全潤濕。小鼠置于70%乙醇潤濕紙巾，剪開將腹部皮膚，無菌取出心臟，將血液拭干，稱重后取1／2投入液氮罐中，－70℃低溫冰箱保存，備反轉錄－聚合酶鏈反應RT－PCR）mRNA檢測。

1.8 檢測指標及方法 RT－PCR法檢測心肌組織腫瘤壞死因子mRNA表達。

1.9 統計學處理 應用SPSS11.0軟件分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組均數間比較用方差分析，兩兩比較用q檢驗。等級資料組間比較應用秩和檢驗。樣本率比較用χ2檢驗。

2 結 果

2.1 小鼠心肌組織TNF－αmRNA電泳條帶比較 TNF－α mRNA在瓊脂糖電泳凝膠上紫外燈下觀察均可見653bp片段，但各組電泳條帶亮度有明顯差異。各組β－actin電泳條帶亮度一致，擴增片段均為432bp。

2.2 小鼠心肌組織TNF－αmRNA電泳產物灰度掃描值變化（見表2） 與正常組相比，模型組、中藥組小鼠TNF－αmRNA表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高、低劑量組TNF－αmRNA表達明顯降低（P＜0.01）；中藥高劑量組與中藥低劑量組相比，心肌組織TNF－αmRNA表達降低的更明顯（P＜0.01）。

表2 TNF－αmRNA電泳產物灰度值變化比較（±s）

表2 TNF－αmRNA電泳產物灰度值變化比較（±s）

組別 n TNF－α／β－actin正常對照組 28 0.003 0±0.000 8模型組 33 0.385 7±0.092 21）中藥低劑量組 39 0.216 6±0.034 31）2）中藥高劑量組 29 0.186 3±0.019 11）2）3）與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與低劑量比較，3）P＜0.01

3 討 論

在病毒性心肌炎發病及其向擴張型心肌病演變的過程中，心肌細胞及浸潤心肌的巨噬細胞和T淋巴細胞，以及心肌組織中的成纖維細胞和內皮細胞等均可合成并釋放腫瘤壞死因子[1，2]。生理情況下，TNF－α具有調節免疫應答、促進細胞生長分化、參與機體免疫應激反應及抗病毒等多種生物活性，但當它們過度產生或長期存在于心肌組織中時，也會對心臟結構和功能造成不利影響。注射外源性重組人TNF－α會使心肌細胞病毒含量增高，心肌壞死及細胞浸潤更嚴重，心肌炎加重。而抗TNF－α抗體能改善其心肌損害，延長存活時間[3]。TNF是病毒性心肌炎發病機制中致心肌損傷的重要因素之一。在非應激狀態下時，正常的心肌組織是不合成及釋放TNF－α，與本實驗中正常對照組小鼠心肌組織中TNF－αmRNA的情況一致。而和正常組小鼠比較，其余各組小鼠心肌組織TNF－αmRNA表達均明顯升高（P＜0.01）。益氣養陰活血方能明顯抑制小鼠心肌組織TNF－αmRNA的表達，減輕由TNF－α所引發的一系列免疫反應，減輕心肌病理形態及超微結構的改變，且以中藥高劑量組的作用最為明顯。益氣養陰活血方的作用機制可能是：早期通過降低心肌TNF－α含量，以減緩炎癥細胞的聚集，活化和炎癥介質的釋放、減輕心肌組織的炎性病變。后期抑制心肌成纖維細胞和間質細胞增生，減緩心肌膠原酶、蛋白酶的合成，防止心肌組織異常增生、肥大及纖維化，減輕DCM的病理損傷[4，5]。通過抑制TNF－α對心肌細胞主要MHC－Ⅱ類抗原異常表達的誘導功能，從而阻斷T細胞介導的一系列自身免疫反應。減輕了對心肌細胞的損害，改善了心肌組織的功能，延緩了慢性心肌炎向DCM發展的進程，對早期擴張型心肌病起到了較好的治療作用。

[1]王哲，楊繼紅，張臘蒲.參麥注射液合用1，6二磷酸果糖治療小兒病毒性心肌炎療效觀察[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2007，5（5）：440－441.

[2]程志清，張娟，劉宏飛.清心Ⅱ號對病毒性心肌炎急性期小鼠Th細胞分化與凋亡干預作用的研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2008，6（1）：44－46.

[3]王再謨，傅榮周，唐章全.現代中藥臨床應用[M].北京：人民衛生出版社，2005：259.

[4]程志清，張娟，劉宏飛.清心Ⅱ號對病毒性心肌炎急性期小鼠Th細胞分化與凋亡干預作用的研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2008，6（1）：44－46.

[5]程志清，張娟，劉宏飛.清心Ⅱ號對病毒性心肌炎急性期小鼠Th細胞分化與凋亡干預作用的研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2008，6（1）：44－46.