麝香通心滴丸對(duì)穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的機(jī)制研究

王 怡，牛子長(zhǎng)，何 斌，解小剛，劉 劍，王未沫

心血管疾病是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，全球每年近2 000萬(wàn)人死于急性心血管事件。易損斑塊是急性心血管事件發(fā)生的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，而穩(wěn)定斑塊、預(yù)防斑塊破裂已成為防治急性心血管事件的重要目標(biāo)［1，2］。麝香通心滴丸是依據(jù)芳香溫通法由古方“至寶丹”化裁而來(lái)，主要由麝香、人參莖葉總皂苷、蟾酥、人工牛黃、丹參、熊膽、冰片等藥物組成，具有芳香開竅、益氣溫陽(yáng)、理氣止痛之功效，以上諸藥寒溫并用，以溫為主；通補(bǔ)兼施，以補(bǔ)為輔，既具芳香溫通之性，藥力又平穩(wěn)和緩。本研究在藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上從脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、基質(zhì)代謝和凋亡等角度，探討麝香通心滴丸穩(wěn)定家兔易損斑塊的作用機(jī)制，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼料 日本大耳白家兔91只，雄性，體重1.8kg～2.2kg，購(gòu)自北大醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。合格證號(hào)：SCXK（京）2005－0002。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，符合《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以上備用。高脂飼料配方，普通飼料89%（天津市武清區(qū)科達(dá)養(yǎng)殖中心）、1%膽固醇、大豆色拉油10%。

1.2 藥物 麝香通心滴丸干粉，黃褐色粉末狀，內(nèi)蒙古伊泰藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，批號(hào)20061120。辛伐他汀，杭州默沙東藥廠生產(chǎn)，批號(hào)070112。

1.3 試劑及儀器 總膽固醇（TC）、中國(guó)斑點(diǎn)蝰蛇毒；組胺、αactin單克隆抗體；CD68單克隆抗體（美國(guó)Thermo）；TC、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）試劑盒（中生北控，批號(hào)070371）；基質(zhì)金屬蛋白酶－（MMP2）、（TIMP2）、單核細(xì)胞趨化因子（MCP－1）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、ox－LDL以及血管黏附分子－1（VCAM－1）ELISA 試劑盒，購(gòu)自美國(guó)RB公司；髓質(zhì)過(guò)氧化物酶（MPO），南京建成，批號(hào)20080423；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成，批號(hào)070603）；TRIZOL總RNA提取試劑盒（美國(guó)Invitrogen）；TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒（美國(guó)Millipore）。

日本Olympus公司正置顯微鏡及成像系統(tǒng)、美國(guó)Image－Pro Plus Version 6.0圖像分析系統(tǒng)；半自動(dòng)生化分析儀（Micro95、荷蘭威圖）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥 家兔根據(jù)血脂隨機(jī)分為正常對(duì)照組（11只，每天給予普通飼料200g）及造模組（80只，每天給予高脂飼料50g，再飼以普通飼料150g）。造模組復(fù)制高脂飲食伴主動(dòng)脈球囊拉傷術(shù)致動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型，模型復(fù)制8周后根據(jù)血脂將其隨機(jī)分為5組：模型組，麝香通心滴丸2mg／kg、1mg／kg和0.5mg／kg組，陽(yáng)性對(duì)照組（辛伐他汀2mg／kg）。各組分別給予相應(yīng)藥物，連續(xù)灌胃給藥12周。

1.4.2 動(dòng)物模型建立 家兔高脂飲食（每天給予高脂飼料50 g，再飼以普通飼料150g）8周，并于高脂飼養(yǎng)兩周后行主動(dòng)脈球囊拉傷術(shù)。

1.4.3 藥物觸發(fā) 給藥第12周末，參照文獻(xiàn)方法［3，4］對(duì)家兔進(jìn)行藥物觸發(fā)，中國(guó)斑點(diǎn)蝰蛇毒0.15mg／kg腹膜下注射，30min后耳緣靜脈注射組胺0.02mg／kg，于處死動(dòng)物前24h、48h給予兩次藥物觸發(fā)。

2 結(jié) 果

2.1 麝香通心滴丸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）家兔血清血脂水平的影響 與正常對(duì)照組比較，AS家兔血清TC、TG、LDL、TC／HDL均明顯升高，其中以TC升高顯著；麝香通心滴丸各劑量組有不同程度降低血脂水平的作用，其中以降低TC／HDL比值的作用顯著（P＜0.05），辛伐他汀組能夠顯著降低家兔血脂水平（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔血清血脂水平的影響（±s）

表1 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔血清血脂水平的影響（±s）

組別 劑量 n TC mmol／L TG mmol／L HDL mmol／L LDL mmol／L TC／HDL正常對(duì)照組 － 11 1.44±0.52 0.70±0.18 0.35±0.16 0.29±0.114.00±1.49模型組 － 12 13.58±7.051） 1.33±0.821） 2.05±0.601） 4.37±2.291） 5.94±1.491）麝香通心滴丸組 0.5mg／kg 9 10.59±3.52 0.60±0.15 2.23±0.40 3.30±1.19 4.67±0.812）麝香通心滴丸組 1mg／kg 11 9.21±5.14 0.64±0.22 1.65±0.70 3.56±2.24 5.30±0.89麝香通心滴丸組 2mg／kg 11 9.99±4.85 0.62±0.20 1.88±0.51 3.42±1.46 5.12±1.44辛伐他汀組 2mg／kg 9 7.39±5.872） 0.48±0.132） 1.30±0.542） 2.51±2.282） 4.23±1.972）與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.2 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔氧化應(yīng)激水平的影響 家兔形成AS后SOD活性明顯降低（P＜0.01），而 MPO、MDA、ox－LDL則明顯升高（P＜0.01）；給予麝香通心滴丸干預(yù)后，血清SOD明顯升高，其中以高、中劑量組為優(yōu)（P＜0.05）；降低MPO、MDA、ox－LDL的血清含量（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔血清SOD活性等指標(biāo)的影響（±s）

表2 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔血清SOD活性等指標(biāo)的影響（±s）

組別 劑量 n SOD（U／mL） MDA（nmol／mL） MPO（U／L） ox－LDL（μg／L）正常對(duì)照組 － 11 218.08±35.89 1.76±0.51 66.18±9.1364.48±9.73模型組 － 12 140.31±39.531） 5.53±2.421） 97.27±27.931） 279.85±28.031）麝香通心滴丸組 0.5mg／kg 9 138.25±43.26 4.02±1.302） 70.11±22.572） 193.96±23.512）麝香通心滴丸組 1mg／kg 11 206.47±31.812） 3.05±0.952） 68.67±13.552） 208.36±15.662）麝香通心滴丸組 2mg／kg 11 184.17±33.732） 4.21±1.482） 62.93±28.212） 201.81±14.592）辛伐他汀組 2mg／kg 9 179.47±14.022） 3.00±0.932） 70.43±29.262） 176.80±14.762）與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.3 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔血清 MMP2、TIMP2含量和活性的影響 模型組血清 MMP2含量及MMP2／TIMP2較正常組明顯升高（P＜0.01）。麝香通心滴丸2mg／kg組可以明顯降低AS家兔血清MMP2含量；麝香通心滴丸2mg／kg、1mg／kg組可以明顯升高TIMP2含量，降低MMP2／TIMP2（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔血清MMP2、TIMP2含量和活性的影響（±s）

表3 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔血清MMP2、TIMP2含量和活性的影響（±s）

組別 劑量 n MMP2（ng／mL） TIMP2（ng／mL） MMP2／TIMP2正常對(duì)照組 － 11 927.25±124.26 439.60±48.76 2.04±0.27模型組 － 12 1 160.62±205.971） 449.47±60.74 2.48±0.251）麝香通心滴丸組 0.5mg／kg 8 1 113.21±165.05 482.43±56.65 2.21±0.222）麝香通心滴丸組 1mg／kg 11 1 050.99±125.06 517.84±58.612） 2.00±0.192）麝香通心滴丸組 2mg／kg 11 1 026.49±132.962） 504.87±78.822） 2.05±0.292）辛伐他汀組 2mg／kg 9 982.98±107.612） 484.16±32.04 1.98±0.182）與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.4 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔主動(dòng)脈MMP2和TIMP2mRNA表達(dá)的影響（見(jiàn)表4）

表4 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔主動(dòng)脈MMP－2、TIMP－2表達(dá)的影響（±s） ng／mL

表4 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔主動(dòng)脈MMP－2、TIMP－2表達(dá)的影響（±s） ng／mL

組別 劑量（mg／kg） n MMP－2 TIMP－2正常對(duì)照組 －10 1.07±0.37 1.00±0.28模型組 － 12 2.84±0.661） 1.79±0.841）麝香通心滴丸組 0.5mg／kg 9 2.34±1.21 2.34±0.89麝香通心滴丸組 1mg／kg 12 1.94±1.202） 2.85±0.831）麝香通心滴丸組 2mg／kg 10 2.63±1.07 2.33±0.87辛伐他汀組 2mg／kg 8 1.78±1.112） 2.62±1.032）與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.5 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔凋亡細(xì)胞密度的影響 （見(jiàn)表5）

表5 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔凋亡細(xì)胞密度的影響（±s）

表5 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔凋亡細(xì)胞密度的影響（±s）

組別 劑量 n 凋亡細(xì)胞密度（／mm2）正常對(duì)照組 － 10 110.60±29.14模型組 0.5mg／kg 8 97.79±39.67麝香通心滴丸組 1mg／kg 8 58.84±29.821）麝香通心滴丸組 2mg／kg 8 78.69±31.201）麝香通心滴丸組 2mg／kg 8 71.95±32.591）與模型組比較，1）P＜0.05

2.6 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔血清相關(guān)炎性因子含量的影響 （見(jiàn)表6）

表6 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔血清炎性因子含量的影響（±s）

表6 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔血清炎性因子含量的影響（±s）

組別 劑量 n MCP－1（pg／mL） VCAM－1（ng／mL） TNF－α（pg／mL）正常對(duì)照組 － 10 482.47±25.97 3 089.51±434.45 126.90±11.80模型組 － 12 564.04±67.811） 3 652.71±476.991） 161.22±24.291）麝香通心滴丸組 0.5mg／kg 9 561.75±58.69 3 319.54±498.73 146.27±18.95麝香通心滴丸組 1mg／kg 12 505.91±30.52 3 351.31±376.70 141.16±13.641）2）麝香通心滴丸組 2mg／kg 10 495.82±36.52 3 321.07±308.52 132.48±11.711）2）辛伐他汀組 2mg／kg 8 498.97±13.52 3 406.37±404.73 137.77±11.451）2）與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

2.7 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔主動(dòng)脈相關(guān)炎性因子mRNA表達(dá)水平的影響 （見(jiàn)表7）

表7 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔主動(dòng)脈相關(guān)炎性因子mRNA表達(dá)水平的影響（±s）

表7 麝香通心滴丸對(duì)AS家兔主動(dòng)脈相關(guān)炎性因子mRNA表達(dá)水平的影響（±s）

組別 劑量 n MCP－1mRNA VCAM－1mRNA TNF－αmRNA正常對(duì)照組 －10 1.01±0.48 1.11±0.43 1.17±0.58模型組 － 12 4.45±3.831） 3.51±1.511） 18.67±13.391）麝香通心滴丸組 0.5mg／kg 9 3.87±3.28 2.89±1.36 10.82±9.21麝香通心滴丸組 1mg／kg 12 1.95±1.842） 2.20±1.682） 8.75±8.732）麝香通心滴丸組 2mg／kg 10 3.80±2.37 2.97±1.38 13.26±7.84辛伐他汀組 2mg／kg 8 1.82±1.142） 2.38±1.46 9.19±7.962）與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

3 討 論

血脂異常是當(dāng)今公認(rèn)的致AS發(fā)生的重要原因之一。隨著AS的不斷發(fā)展，斑塊中的脂質(zhì)沉積也不斷增多，并逐漸形成脂核。斑塊中過(guò)大的脂核會(huì)增加管壁在斑塊肩部的應(yīng)力，從而升高斑塊的易損性，而肩部也是斑塊破裂最常發(fā)生的部位，可見(jiàn)血脂異常和斑塊易損密切相關(guān)［5］。本實(shí)驗(yàn)觀察了麝香通心滴丸對(duì)AS家兔血脂的影響，結(jié)果顯示各劑量組雖有降低TC、TG、LDL的趨勢(shì)，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。麝香通心滴丸對(duì)脂質(zhì)的影響并非是穩(wěn)定易損斑塊的主要機(jī)制。

氧化應(yīng)激貫穿于AS發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程。在AS早期機(jī)體抗氧化能力下降，氧自由基生成增加會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致單核細(xì)胞黏附，脂質(zhì)沉積于動(dòng)脈內(nèi)膜下。而其對(duì)于脂蛋白的氧化修飾，特別是ox－LDL的生成則對(duì)AS的發(fā)生及易損斑塊的形成起到了關(guān)鍵的作用。由此可見(jiàn)提高機(jī)體抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激損傷，降低ox－LDL及MPO的含量應(yīng)是防治易損斑塊的可能途徑。本實(shí)驗(yàn)中麝香通心滴丸可以明顯提高家兔血清SOD的活性，降低血清MDA含量、MPO活性以及ox－LDL含量（P＜0.05）。提高機(jī)體抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激損傷應(yīng)是其穩(wěn)定斑塊的作用機(jī)制之一。

斑塊的纖維帽是覆蓋于脂核上的纖維肌性組織，主要由少量的平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）構(gòu)成。ECM尤其是膠原纖維合成和降解代謝的失調(diào)是造成斑塊易損、誘發(fā)斑塊破裂的重要原因。平滑肌細(xì)胞是斑塊中ECM合成的主要來(lái)源，而其降解則主要是由MMPs來(lái)完成的［6］。

斑塊中MMPs表達(dá)和活性的升高會(huì)造成ECM降解的增強(qiáng)，直接導(dǎo)致斑塊纖維帽變薄，易損性增加。而TIMP則是MMPs在組織中的天然抑制劑，在體內(nèi)局部組織的TIMP可以按1∶1的分子比例以非共價(jià)鍵結(jié)合活化的MMPs，抑制其對(duì)特異性ECM蛋白的降解，也可與酶原結(jié)合阻止其活化。MMPs與TIMP的失衡則可以造成斑塊內(nèi)基質(zhì)代謝失調(diào)，直接導(dǎo)致纖維帽變薄、破裂［7－11］。所以抑制 MMPs的過(guò)度表達(dá)和活性增高也成了防治易損斑塊的研究方向之一。本實(shí)驗(yàn)顯示其可以降低AS家兔血清MMP2含量，升高TIMP2含量，并降低兩者比值（P＜0.05）。提示麝香通心滴丸可以通過(guò)降低MMP2的含量及活性防止斑塊內(nèi)基質(zhì)的過(guò)度降解，穩(wěn)定斑塊。

炎癥反應(yīng)可以通過(guò)釋放多種炎癥介質(zhì)增加斑塊的易損性，導(dǎo)致斑塊破裂：血管內(nèi)皮受損后 MCP－1、ICAM－1、VCAM－1的協(xié)同作用下進(jìn)入到血管內(nèi)皮下，并在巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM－CSF）的作用下活化形成巨噬細(xì)胞，通過(guò)清道夫受體吞噬ox－LDL，形成泡沫細(xì)胞，由于脂質(zhì)的不斷攝入，泡沫細(xì)胞最終崩解形成脂核 ，隨著脂核的不斷增大，斑塊的易損性升高。巨噬細(xì)胞可以通過(guò)分泌IL－1、TNF－α，上調(diào) MMPs的表達(dá)，促進(jìn)斑塊內(nèi)的基質(zhì)降解，誘發(fā)斑塊破裂。大量的組織因子，誘發(fā)血栓形成［12］。減少斑塊內(nèi)的炎癥細(xì)胞，抑制相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放，減輕斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)是防治易損斑塊的主要機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，麝香通心滴丸2mg／kg和1mg／kg可以明顯降低AS家兔血清TNF－α含量（P＜0.01），而對(duì)于血清中MCP－1和VCAM－1含量有降低趨勢(shì)。麝香通心滴丸可以通過(guò)減少斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞，減少TNF－α的分泌，從而減輕炎癥反應(yīng)，防止易損斑塊形成。

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