馬鈴薯黑痣病菌菌絲融合群的鑒定

田曉燕，蒙美蓮，張笑宇，董瑞利，胡 俊

（內蒙古農業大學農學院，內蒙古 呼和浩特 010019）

馬鈴薯是世界第四大糧食作物，僅次于水稻、小麥和玉米[1]。中國是一個馬鈴薯生產大國，其總產量和面積均占世界第一位。馬鈴薯的營養價值很高，除含有大量淀粉、蛋白質，還含有豐富的維生素A和C以及礦物質[2]。近年來，隨著馬鈴薯產業的迅猛發展，馬鈴薯種植面積逐漸擴大，種薯調用頻繁，重迎茬問題比較普遍，在馬鈴薯種植區黑痣病日趨加重，且發病較為普遍，一般可造成馬鈴薯減產15%左右，個別年份可達全田毀滅[3]。2009年調查了內蒙古烏蘭察布市馬鈴薯種植區，嚴重的地塊馬鈴薯黑痣病發病率高達90%，該病嚴重影響著馬鈴薯的產量與品質，阻礙了馬鈴薯產業的發展。

馬鈴薯黑痣病又稱“黑色粗皮病、莖潰瘍病”，是一種重要的土傳真菌性病害，其病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）[4]。國際上運用菌絲融合技術將立枯絲核菌分成不同的群系/融合群（Anastomosis group簡稱AG），許多植物病理學家又分別予以生理、生化、病理遺傳等方面的研究。為了研究馬鈴薯黑痣病菌菌絲融合群組成、分布和親和群的組成情況，本試驗對采自不同地區的馬鈴薯黑痣病菌進行了菌絲融合群鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的分離

從內蒙古自治區呼和浩特市和烏蘭察布市、山西省大同市、陜西省榆林市、黑龍江省等地的馬鈴薯上采集具有黑痣病典型癥狀的新鮮病害標本，采用組織分離法，將病組織在PDA平板上于25℃下恒溫培養48 h后，挑取病組織周圍長出的尖端菌絲，移入PDA平板純化培養。將認為是立枯絲核菌的菌株通過鏡檢、形態學鑒定和致病性測定，確認為病原菌后保存備用。

1.2 標準菌株來源

由華南農業大學周而勛教授惠贈的AG-1-ⅠA、AG-1-ⅠB、AG-2-1、AG-2-ⅢB、AG-3 共 5個菌株為標準菌株。

1.3 核相測定

參照張天曉[5]的方法，采用番紅染色。將活化后的菌株接入培養皿內，在菌餅周圍培養基上斜插入4個蓋玻片。25℃恒溫培養，待菌絲生長至蓋玻片的1/2處時取出，經番紅O-KOH染色1～2 min后，在光學顯微鏡下觀察其細胞核數目。每個菌株重復3皿。

1.4 菌絲融合群測定

參照陳延熙等[6]的玻片對峙法，將待測菌株與標準菌株同時置于25℃恒溫條件下培養48 h后，用打孔器在菌落邊緣切取直徑5 mm的菌餅。在無菌載玻片上涂一薄層水瓊脂（WA）培養基，挑取標準菌株菌餅置于玻片中央，同一待測菌株菌餅分放兩側，與標準菌株間隔1.2～1.5 cm。將載玻片放在注有少量無菌水的無菌培養皿內，25℃恒溫條件下培養24 h，當兩菌落前緣生長相遇并交疊 5 mm時，鏡檢二者菌絲融合情況。每菌株重復3次。

菌絲融合群的鑒定標準如下：

A完全融合：接觸細胞間細胞壁溶解，原生質融合，互有引誘現象；

B不完全融合：菌絲接觸，細胞壁溶解后細胞死亡；

C完全不融合：細胞壁不溶解，兩菌互不干擾對方，交叉而過。

1.5 營養親和群的鑒定

將同一融合群的所有菌株，按3個一組，成正三角形排列接種于 PSA培養基上。25℃下對峙培養2～4 d，觀察其生長情況，每組重復3次。根據兩菌株間菌絲交會處分離帶的有無判斷兩菌株是否親和，無分離帶的視為同一親和群，有分離帶的視為不同親和群。通過合理組合，使同一菌株與其他各菌株間均得到對峙比較，以此對所有菌株進行親和群判別。

2 結果與分析

2.1 供試菌株分離鑒定結果

從各地區采集的馬鈴薯黑痣病標樣中分離出44個分離物，經鑒定和致病性測定，均為馬鈴薯黑痣病菌（表1）。

表1 馬鈴薯黑痣病菌菌株編號及其采集地點Table 1 R.solani strains isolated from potatoes in different areas

圖1 供試菌株（24號菌）多核形態圖Figure1 Morphologic characters of multinucleate R.solani strain（24th strain）

圖2 供試菌株不親和表現Figure2 Strains were not compatible

表2 各融合群內不同營養親和群出現頻率Table2 Frequencies of anastomosis groups(AGs)and their vegetative compatibility groups(VCGs)

2.2 核相測定結果

經細胞核染色核相鑒定結果表明，所有供試菌株均為多核，幼期營養菌絲細胞核數為3～18個（圖1）。

2.3 菌絲融合群測定結果

根據菌絲融合群的鑒定標準，44個供試菌株分為3個類群：AG-1-ⅠB（1個，為完全融合）；AG-3（38個，除了39，40，41，42，43號為不完全融合外，其余均為完全融合），非融合類（5個，為完全不融合）。結果表明AG-3為馬鈴薯種植區的優勢融合群，所占比例為測定菌株的86.36%。AG-1-ⅠB融合群所占比例較少，僅為2.27%（表2）。

2.4 營養親和群鑒定結果

圖3 供試菌株親和表現Figure3 Strains were compatible

經過供試菌株的合理組合、對峙培養（圖2、圖3），結果顯示：44個菌株可被劃分為19個不同的營養親和群。表明了馬鈴薯黑痣病菌菌絲融合群下具有明顯的營養親和群的分化，并且各親和群出現頻率差異很大。AG-3-5出現頻率最高（15.79%），AG-3-1、AG-3-2、AG-3-8出現頻率次之（13.16%），AG-3-10、AG-3-11、AG-3-12、AG-3-13、AG-3-14、AG-3-15和AG-3-16出現頻率最低（2.63%），可見不同馬鈴薯種植區黑痣病菌菌絲融合群的優勢親和群為AG-3-5（表2）。

3 討 論

絲核菌是一類在自然界中廣泛存在的真菌，全世界各地的耕作土壤中均有分布，其中有許多種很容易從染病植株及土壤中分離得到。絲核菌的寄主范圍極廣，根據報道絲核菌可侵染43科200余種植物。迄今為止，立枯絲核菌的融合群己增至12個，而融合亞群至少已有18個[7]。國內學者對我國部分作物上的立枯絲核菌融合群進行了較多的研究。彭學文等[8]報道，在墨西哥引起馬鈴薯莖基腐的立枯絲核菌的融合群為AG-3和AG-4。AG-3和AG-4各占73.5%、26.5%。

本試驗根據現已得到的標準菌株初步研究了不同地區馬鈴薯黑痣病菌融合群的鑒定分類。從不同地區馬鈴薯種植區采集的病樣上分離獲得的立枯絲核菌44株，在地域、品種和耕作方法上均有一定的代表性，基本上能反映馬鈴薯黑痣病發生和分布特點等實際情況。本試驗通過載玻片定位融合法判別與判定，初步確定了不同地區馬鈴薯黑痣病病原菌立枯絲核菌菌絲融合群有AG-3和AG-1-ⅠB兩個，不同菌絲融合群間在地域分布、出現頻率上均有一定差異。其中AG-3出現頻率最高，分布最廣，是馬鈴薯黑痣病的優勢融合群。說明馬鈴薯黑痣病菌在不同地區存在分化現象和優勢融合群，這一結果與彭學文等[8]報道一致。據陳延熙等[6]的測定結果，AG-1-ⅠB菌株是分離自那些類似紋枯病癥狀的鵝觀草和狗尾草上的菌株，AG-3菌株是馬鈴薯莖基腐病原菌。但本試驗37號菌是從馬鈴薯上分離得到，卻歸入AG-1-ⅠB融合群，這一點卻不同于前人的研究。

本試驗結果顯示，在供試的立枯絲核菌菌株中，來源于不同地域的馬鈴薯黑痣病菌菌株經鑒定屬于同一菌絲融合群下的同一親和群，如28號菌與31號、32號等分別采自內蒙古烏蘭察布市四子王旗和陜西省榆林市，測定同屬于AG-3-5融合群；而來源于同一地區的馬鈴薯黑痣病菌卻屬于不同的親和群，如43號和44號菌雖然同采于內蒙古烏蘭察布市卓資縣，卻分屬于AG-3-8和AG-3-9兩個親和群。這表明了引起馬鈴薯黑痣病的立枯絲核菌類群的復雜性，可能與地區生態條件差異有一定關系并且在地域上具有一定的類群差異。由于融合群的標準菌株有限，以至于5個菌株未被鑒定出其所在的融合類群，有待于進一步的深入研究。本試驗從總體上反映了絲核菌分布的多樣性、豐富性以及融合群間關系的復雜性。

[1]白曉東,杜珍,范向斌,等.基質對馬鈴薯瘡痂病抑制效果研究初報[J].中國馬鈴薯,2002,16(6):332-334.

[2]徐征.土壤生態調控馬鈴薯晚疫病發生的研究[D].重慶：西南大學,2006.

[3]邱廣偉.馬鈴薯黑痣病的發生與防治[J].糧食作物,2009(6):133-134.

[4]李乾坤,孫順娣,李敏權.馬鈴薯立枯絲核菌的研究[J].馬鈴薯雜志,1998,2(2):79-85.

[5]張天曉.Rhizoctonia solani菌絲融合群的研究[J].湖南師范學院學報,1984(2):69-7l.

[6]陳延熙,張敦華,段霞渝,等.關于Rhizoctonia solani菌絲融合分類和有性世代的研究[J].植物病理學報,1985,15(3):139-143.

[7]Ogoshi A.Studies on the taxonomy of the genus Rhizoctonia[J].Ann Phytopath Soc Japan,1984,50:307-309.

[8]彭學文,朱杰華.河北省馬鈴薯真菌病害種類及分布[J].中國馬鈴薯,2008,22(1):31-33.