UPS抑制劑對成年大鼠腦內淀粉樣蛋白沉積和神經新生的影響

高 林 田元元 薛 春 商超蔚 李林英 王慧宇 苗云飛 亢園園 賀維亞

河南大學臨床學院 開封 475000

阿爾茨海默病（Alzheimer＇s disease，AD）的病理改變以腦組織內出現老年斑、神經原纖維纏結及神經元丟失為特征。而Aβ的沉積是其發病的中心環節［1］。另外，Dickson等人報道［2］，正常老年人尸檢也能見到老年斑，但卻未發病，看來AD和正常老年人之間并無質的區別。為此，我們認為這可能與腦內異常蛋白的處理、降解β淀粉樣蛋白的處理能力（也即泛素－蛋白酶體系統）不同有關。筆者采用腹腔注射泛素－蛋白酶體抑制劑，建立腦內淀粉樣蛋白沉積大鼠模型，以觀察大鼠行為學、腦內淀粉樣蛋白和神經新生的影響，探討阿爾茨海默病的發病機制和制定治療策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與藥品：①試劑：尿嘧啶脫氧核苷（bromodeoxyuridine，BrdU）購于美國Sigma公司。BrdU抗體、鏈霉卵白素（SP）染色試劑盒和二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒均購自北京中山試劑公司。②水迷宮（張家港生物醫學儀器廠），江灣Ⅰ型C立體定向儀（第二軍醫大學），微量注射器（上海華亭精密儀器廠）。

1.1.2 實驗動物：成年雄性SD大鼠57只，鼠齡2個月。體質量200～300g，平均260g左右，均由鄭州大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 學習記憶測試方法：大鼠適應性喂養1周后，進行水迷宮測試。5次／d，2min／次，共5d。第3d開始記錄逃避潛伏期（大鼠從入水至找到并爬上平臺所需時間），一般在第3d動物逃避潛伏期均在20s內。如在第5天，動物逃避潛伏期仍大于20s即作為淘汰指標。共淘汰12只動物，其中死亡6只，1只視力障礙。造模2個月后，再次行水迷宮測試，5次／d，2min／次，共5d，第3天開始記錄逃避潛伏期。

1.2.2 分組與動物模型制備：57只大鼠分別分為實驗組（腹腔注射泛素－蛋白酶體抑制劑）、對照組和正常空白組等3組，實驗組15只，對照組15只，空白組15只動物。參照Ni等［1］的方法制備大鼠模型（腹腔注射泛素－蛋白酶體抑制劑0.03mg／kg），對照組給予同體積的生理鹽水。所有大鼠手術后均置于通風的動物房飼養60d后，各組進行行為學習記憶測試。飼養和造摸期間共淘汰9只（實驗組3只，對照組4只，空白組2只）。

1.2.3 免疫組化檢測：①BrdU染色法［3］：腹腔注射Brdu（50 mg／kg），1次／8h，3次／d，連續注射5d。末次注射24h后經左心室常規灌注多聚甲醛沖洗，常規固定、脫水、浸蠟、包埋，石蠟切片，層厚約為5μm，免疫染色步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，腦組織切片用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，2min／次。DNA變性處理：50%formamide／2×SSC（枸櫞酸鹽水）于65℃下共反應2h，傾去液體后以2×SSC沖洗5min；2mol／L鹽酸37℃處理30min；以pH 值為8.5的硼酸緩沖液沖洗后室溫下反應10～15min，而后用含10%血清、0.1%Ttiton 100的磷酸鹽緩沖液37℃封閉30min，加入鼠抗Brdu 4℃過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，10min／次；加入稀釋的生物素化兔抗小鼠二抗（1∶80），37℃反應2h；磷酸鹽緩沖液沖洗3次，5min／次；加入辣根過氧化物酶室溫下反應1h后DAB顯色，室溫晾干，二甲苯透明后中性樹膠封片。于光學顯微鏡下觀察海馬齒狀回神經前體細胞增殖情況。②改進的甲醇剛果紅染色：行為學記憶測試結束后，斷頭取腦，用冰凍生理鹽水沖去血漬，置新配4%多聚甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋。取海馬腦組織塊做冠狀切片，常規脫臘至水，Harris蘇木精染色5～10min，溫水顯藍，自來水沖洗數分鐘，1%鹽酸酒精分化數秒鐘，溫水顯藍，自來水沖洗數分鐘，甲醇剛果紅染色15min，自來水沖洗數分鐘，0.2%酒精分化數秒鐘，溫水顯藍，自來水沖洗數分鐘，常規脫水、透明、封片。

1.2.4 半定量分析：每只大鼠隨機選取6張非連續腦組織切片，于光學顯微鏡下任選5個高倍視野（×200）觀察計數雙側海馬區BrdU標記的陽性細胞數量。采用雙盲隨機法計算視野中陽性細胞數。

2 結果

2.1 學習記憶測試 正常空白組和對照組大鼠的學習記憶測試結果比較差異無統計學意義（P＞0.05）；實驗組大鼠的學習記憶能力明顯低于正常空白組（P＜0.05）。見表1。

2.2 免疫組化檢測

2.2.1 BrdU染色：光學顯微鏡下觀察顯示，各組大鼠海馬區BrdU陽性細胞呈單個或兩個分布，細胞核形態規則，主要分布于齒狀回顆粒細胞層亞顆粒增生帶中（圖1～3）。實驗組大鼠海馬區BrdU陽性細胞計數顯著減少，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期和海馬區BrdU陽性細胞數比較 （）

表1 各組大鼠逃避潛伏期和海馬區BrdU陽性細胞數比較 （）

注：實驗組與對照組比較，▲P＜0.05；與空白組比較，●P＜0.05；對照組與空白組相比較，△P＞0.05

2.2.2 剛果紅染色：對照組與空白組（圖4）相比，海馬區可見神經元旁有少量的染色陽性物質，其周圍神經元形態基本正常，細胞排列層次稍有紊亂（圖5）。實驗組與空白組相比，海馬區可見神經元旁有大量的染色陽性物質，其周圍神經元皺縮，細胞排列層次明顯紊亂，可見明顯的膠質細胞浸潤（圖6）。

3 討論

β－APP（β－amyloid precursor protein）是一種跨膜蛋白，廣泛表達在各種類型和腦各部分的神經元，生理情況下合成后的APP僅10%成為跨膜蛋白，大部分在胞內被α－分泌酶水解生成具有明顯神經營養作用的可溶性 Appα［4-5］。同時β－APP也是一種應激蛋白，在有害刺激作用下，β－APP表達上調，Aβ生成增加而可溶性Appα減少。但正常情況下機體修復機制可以及時降解應激時產生的Aβ而避免其累積［6-7］。

泛素－蛋白酶體系統（ubiquitin－proteasome sytem，UPS）是真核細胞內重要的非溶酶體蛋白降解通路。UPS能夠利用其末端76位的甘氨酸與目的靶蛋白的α或ε－氨基共價結合，使目的蛋白能夠帶上泛素化標記，以便進一步降解。細胞內蛋白的泛素化作用參與了多種細胞生物學功能，例如細胞周期進程、細胞增生與分化、細胞凋亡等［8］。在UPP中E3連接酶是其選擇性降解機制的關鍵因素，能夠將Ub、底物蛋白還有26S蛋白酶體連接起來，起到了橋梁的作用。UPP中E3連接酶的數量眾多，有研究表明，其中多種E3連接酶如parkin、HRD1、CHIP等都能夠參與調控AD中兩個重要效應分子tau蛋白和Aβ的降解［9-10］。本實驗結果表明，腹腔注射泛素－蛋白酶體抑制劑2個月后，空白組未發病，說明空白組修復機制是正常的，可以降解或吞噬大量的Aβ而避免其沉積發揮神經毒性，保護了周邊的神經元。而實驗組結果說明機體的修復機制存在障礙，沉積的淀粉樣蛋白使得其周邊的神經元皺縮或丟失，從而表現出行為學習記憶障礙。本實驗提示我們：泛素蛋白酶體系統衰退，促使了淀粉樣的沉積。

在本實驗中，經尿嘧啶脫氧核苷標記染色后顯示實驗組大鼠海馬區神經前體細胞增殖能力明顯下降，分析原因可能與淀粉樣蛋白沉積對大鼠海馬區神經前體細胞的增殖有抑制作用，這與體內［8］和體外［11-12］實驗研究淀粉樣蛋白對PC12細胞的增殖有抑制作用相一致。至于淀粉樣蛋白對神經前體細胞的抑制作用是通過什么信號傳導途徑需進一步研究和探討。

圖1 空白組海馬區Brdu陽性細胞數（×200）

圖2 對照組海馬區Brdu陽性細胞數（×200）

圖3 實驗組海馬區Brdu陽性細胞數（×200）

圖4 空白組海馬區淀粉樣蛋白沉積的變化（×200）

圖5 對照組海馬區淀粉樣蛋白沉積的變化（×200）

圖6 實驗組海馬區淀粉樣蛋白沉積的變化（×200）

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