慢性腦缺血大鼠OXR表達的實驗分析

呂 斌 婁季宇 張 萍 李文杰

1）河南省食品藥品檢驗所 鄭州 450003 2）鄭州大學第二附屬醫院 鄭州 4500143）鄭州市第一人民醫院 鄭州450002 3）鄭州大學公共衛生學院 鄭州 450001

本文通過結扎雙側的頸總動脈法，建立慢性腦缺血大鼠模型，觀察大鼠腦組織OX1R、OX2R的表達及其隨時間變化的情況，探討其引起改變的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 SPF級SD大鼠月齡12～14個月，體質量300～350g，雄雌不限，由鄭州大學醫學院實驗動物中心提供。山羊抗多克隆OX1R抗體、OX2R抗體500μg／mL，購自Santa Cruz公司，SP免疫組化試劑盒（山羊）購自北京中山生物試劑公司。其他試劑為進口分裝優級純。

1.2 慢性腦腦缺血大鼠模型建立及實驗分組 參照Ohta等［1］方法制作慢性腦缺血大鼠模型。大鼠術前12h禁食，4 h禁水。用1%戊巴比妥鈉（10mg／kg）腹腔進行注射麻醉，保證在手術期間有自主呼吸。仰臥固定，頸前部去毛消毒后，沿頸正中切開，分離出雙側頸總動脈，雙重絲線給與結扎，術中大鼠肛溫保持在36.5℃～37.5℃，手術后動物送至有通風和空調設備的動物房飼養。實驗動物隨機分為正常組、假手術組、模型組，正常組不予處理常規飼養，假手術組動物僅行頸前切開，不結扎頸總動脈，模型組又分為15d、1個月、2個月共3個亞組，均在相同的時間點處死。每組各12只。

1.3 大鼠的學習記憶能力測試結果 采用水迷宮法，進行大鼠記憶功能的測定。各組大鼠手術前先進行訓練。正式訓練前先將大鼠放在安全臺的附近，讓其自行游上安全臺2次，然后再分別從中間點、起點各讓其自由游上安全臺，進行預訓練，去除靈活性過差的大鼠，對其余大鼠進行正式訓練，直到大鼠連續3次從起點到達終點，游迷宮所需時間差＜10 s，錯誤次數＜1次，即為訓練成功。對已經過訓練的大鼠，分別于術后不同時間點再次游迷宮，衡量該大鼠記憶功能，以大鼠自迷宮起點至安全臺終點所需時間（即逃避潛伏期）為衡量記憶功能的指標，連測10次，取其平均值。

1.4 腦組織切片制備和腦組織OXR表達測定、OX1R雙標免疫熒光測定 各組動物達到規定的時間點時，采用10%水合氯醛麻醉（3～5mL／kg），用20mL的注射器接穿刺針，小心插入左心室，同時剪開右心耳，注入滅菌過的溫生理鹽水，直至流出的液體變清后，再灌注4%多聚甲醛0.1mol／L PBS（pH 7.2）約60mL，再斷頭取腦，之后，置4%多聚甲醛0.1mol／L PBS固定液，浸泡8h，作常規固定、石蠟包埋，連續冠狀切片，片厚為2μm。取2張連續切片，分別用于OX1R、OX2R抗體進行免疫組化染色。應用SP染色試劑盒，進行免疫組化染色，操作步驟參照試劑盒說明書進行。一抗濃度為分別為1∶200、1∶100，4℃過夜；滴加生物素化二抗，37℃孵育20min；滴加試劑SP，37℃孵育20min，DAB顯色，鏡下控制時間，光鏡觀察，鏡下計數。采用盲法計數，OX1R主要表達于CA1區，OX2R主要表達于CA3區［5］，OX1R每張切片的皮層、海馬CA1區，OX2R每張切片的皮層、海馬CA3區計數5個視野1000個細胞，數出陽性細胞數。

雙標免疫熒光測定取15d模型組部分切片，嚴格按照雙標免疫熒光步驟對OX1R抗體進行雙標免疫熒光測定，在激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS，FV300）下觀察OX1R的表達。

2 結果

2.1 行為學評價 結果表明，假手術組的逃避潛伏期［（38.146±13.232）s］與正常組［（32.427±19.206）s］比較，差異無統計學意義（P＞0.05），且與其他各組比較的統計學差異結果均一致。模型組15d逃避潛伏期（96.502±25.571）s，較正常組顯著延長（P＜0.01），說明缺血15d時大鼠的學習記憶能力有明顯減退。模型組1個月逃避潛伏期［（74.607±26.543）s、2個月（67.834±27.350）s］與模型組15d比較有統計學意義（P＜0.01）。說明隨著距離缺血時間點遠離，大鼠的學習記憶能力較15d模型有所好轉；與正常組進行比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；模型組2個月逃避潛伏期與模型組1個月比較差異無統計學意義（P＞0.05）。說明模型組仍未能達到正常組水平；模型組2個月較1個月學習記憶能力進一步好轉。

2.2 OX1R、OX2R的表達 見表1。結果顯示：模型組15d時的OX1R的表達與正常組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；15d后明顯下降，1個月時與正常組無統計學差異；2個月時與模型組15d差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 皮層、海馬CA1區OX1R及皮層、海馬CA3區OX2R陽性表達的細胞數

2.3 各組大鼠海馬周圍神經纖維OX2R表達的平均灰度值比較 見表2。15d時神經纖維的著色與正常組相比差異有統計學意義。（P＜0.01）；1個月時與15d時比較差異有統計學意義（P＜0.01），與正常組比無統計學差異；2個月時與1個月比較差異無統計學意義，與模型組15d比較差異有統計學（P＜0.01）。

表2 各組大鼠海馬周圍神經纖維OX2R表達的平均灰度值比較

2.4 模型組15d時海馬CA1區，OX1R的雙標免疫熒光 見圖1～圖3。NSE是標記神經元特異性抗體，由此證明OX1R確實可以表達于神經元。

圖1 一抗為山羊抗大鼠OX1R抗體，二抗兔抗山羊CY3標記的熒光圖片（紅色）

圖2 一抗為小鼠抗大鼠NSE抗體，二抗為羊抗小鼠FITC標記的熒光圖片（綠色）

圖3 激光共聚焦顯微鏡下的雙標圖片（黃色）

3 討論

Orexin及其受體的生理功能與攝食、調節營養與能量平衡、睡眠覺醒周期、神經內分泌及行為等多方面因素有關［3］。Irving等的研究發現，急性大鼠腦缺血時OX1R表達會增高［2］。本研究采用免疫組化法，觀察慢性缺血性腦損傷，發現OXR表達會隨缺血時間的改變而變化，表明orexin系統與慢性缺血性腦損傷的相關病理過程有關，具體機制有待進一步研究。

腦組織缺血早期，機體各種因素首先刺激下丘腦Orexin釋放表達，進而促進NPY、皮質激素釋放因子、ACTH的升高，導致糖皮質激素、腎上腺素增加，體內自主神經系統過度活化。然而大量的CRH、糖皮質激素和NPY會對下丘腦Orexin產生強烈的抑制作用，加上自由基的破壞作用，最終使Orexin表達能力下降。因此，會從腦缺血的急性期持續到15dOXR表達的增高。缺血15d后，免疫和應激反應減弱，CRF、糖皮質激素、自由基和NPY水平會下降，Orexin表達能力開始上升，恢復新的平衡［4］。OXR表達下降，在1m時較15d時明顯下降。在腦缺血的后期，機體會促進修復下丘腦OXR的表達，因此缺血1個月后OXR逐漸增多，腦缺血2m時明顯升高。

從組織學角度看，腦缺血15d時部分神經細胞將萎縮、缺血1m時大部分神經細胞體積有縮小現象、胞核濃縮、深染、結構不清。在腦缺血2個月時部分細胞形態基本恢復正常。從信號傳導角度分析，Orexin系統在慢性缺血性腦損傷的病理過程中，起到雙向調控的作用。腦缺血的早期Orexin與OXR結合后，通過Gq信號途徑與磷脂酶C（PLC）產生偶聯，能激活細胞膜上的PLC，進而催化質膜磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）的水解，生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG）。細胞內Ca2＋超載，鈣蛋白酶被過度激活，引起其底物蛋白的過度降解，使細胞周期停止在G2期，導致細胞損傷或凋亡［5］。腦缺血后期OXR激活了Gs的信號途經，激活cAMP依賴的蛋白激酶，使cAMP含量升高，促進下游基因產物如腦源性神經生長因子、Bcl－2、c－Fos等的表達，促進缺血后神經細胞的存活和再生［6］。

OX1R在腦內分布很廣泛，大鼠的海馬、皮層、下丘腦等部位均能OX1R表達，而OX1R主要表達于神經細胞的胞漿和胞膜，部分膠質細胞內也有OX1R表達。膠質細胞能為神經細胞的再生提供充足的營養，提示膠質細胞的OX1R表達可能會有神經保護作用。NSE是特異標記神經元的抗體，本研究通過雙標免疫熒光證實OX1R的確在神經元有表達，與已往研究相一致。

本研究還發現，OX2R除表達于上述部位神經元外，在皮層的深層也有表達，而OX1R沒有這種表達，這在以前的研究中未曾見過報道。原位雜交結果表明OX1R和OX2R mRNA的分布有顯著差異，其原因可能為OX2R在皮層的表達主要在皮質的深層，而神經纖維主要集中在皮質的深層，所以OX2R有較強的神經纖維著色。

OXR在慢性腦缺血的表達及其變化揭示了腦神經細胞損傷、修復的整個變化過程。腦缺血時細胞形態的變化及記憶能力明顯下降，均支持OXR與神經細胞的凋亡有一定關系，與Voisin等［7］的研究結果相符。而缺血2月時部分細胞形態的恢復，及2月時大鼠的學習記憶能力的明顯好轉，可能與OX2R介導的細胞保護作用有關，與Katsuki等［8］的研究結果一致。因此OXR在慢性腦缺血中起雙向調節作用，其具體機制有待進一步研究。

［1］OhtaH.NishikawaH.KimuraH，et al.Chronic cerebral hypoperfusion by permanent internal carotid ligation produces learning impairment without brain damage in rats［J］.Neuroscience，1997，79（4）：1039－1050.

［2］Irving EA，Harrison DC，Babbs AJ，et al.Increased cortical expression of the orexin－1receptor following permanent middle cerebral artery occlusion in the rat［J］.Neurosci Lett，2002，324：53－56.

［3］Smart D，Jerman J.The physiology and pharmacology of the orexins［J］.Pharmacol Ther，2002，94：51－61.

［4］Taylor MM，Samson WK.The other side of the Orexins：endocrine and metabolic actions［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2003，284：E13－17.

［5］Ray SK，Fidan M，Nowak MW，et al.Oxidativestressand Ca2＋influx and upregulate calpain and induce apoptosis in PC12cells［J］.Brain Res，2000，852：326－334.

［6］Neves SR，Ram PT，Iyengar R.G Protein pathways［J］.Science，2002，296：1636－1639.

［7］Voisin T，El Firar，Avondo V，et al.Orexin－induced apoptosis：the key role of the seven transmembran domain orexin type2 receptor［J］.Endocrinology，2006，7：1－32.

［8］Katsuki，Hiroshi，Akaike，et al.Quinolinic acid toxicity on orexin neurons blocked by gamma aminobutyric acid type A receptor stimulation［J］.Lippincott Williams ＆ Wilkins，Inc，2005，16（11）：1157－1161 .