人胚胎干細胞神經分化中VEGF作用的分子機制研究

焦淑潔 許慧芳 張蘇明 許 杰 湛延強

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院神經內科 武漢 430030 2）鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

研究表明絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號轉導途徑在中樞神經系統廣泛表達，各種細胞外刺激信號，均可通過這一通路影響突觸傳遞，神經元的重塑、形態分化和生存等。目前已發現哺乳動物腦組織細胞至少有4種嚴格調節的MAPK，其中發揮主要作用的為p38α，參與多種細胞的調控增殖。本實驗前期發現在體外VEGF能夠促進人胚胎干細胞神經分化［1］，給予p38 MAPK信號通路抑制劑，檢測細胞內p38αmRNA的變化，以觀察MAPK信號轉導通路是否在VEGF促神經細胞生長和分化中發揮作用，從而進一步了解VEGF在體外hESCs神經分化中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 人胚胎干細胞及相關培養基 人胚胎干細胞系TJMU1和TJMU2，由本實驗室與同濟醫院生殖中心前期研究人員建系［2］，本實驗室保存。誘導分化相關培養基：（1）hESCs培養基：KNOCKOUT DMEM（Gibco）、血清替代物（Gibco）、L－谷胺酰胺（Hyclone）、非必需氨基酸（Hyclone）、β－巰基乙醇（Sigma）、重組堿性成纖維細胞生長因子（basic－fibroblast growth factor，bFGF）（Sigma）及青鏈霉素（Hy－clone）。（2）擬胚體（Embryonic body，EB）培養基：hESCs培養基去除bFGF。（3）神經干細胞培養基：DMEM／F12（Hyclone）、B27（Gibco）、Noggin（R＆D）、bFGF、非必需氨基酸、L－谷胺酰胺及青鏈霉素。（4）神經元培養基：DMEM／F12、ITS（Sigma）、N2（Gibco）、腦源性神經生長因子（R＆D）、表皮生長因子（R＆D）、B27、L－谷胺酰胺、非必需氨基酸及青鏈霉素。

1.2 其他實驗試劑 VEGF（Peprotech）；p38MAPK 抑制劑SB203580：Sigma；抗Nestin抗體（神經干細胞標志）；抗微管相關蛋白－2（anti－microtubule－associated protein 2，MAP－2，成熟神經元標志）多克隆抗體（Chemicon）；DAPI（Sigma）；FITC標記的熒光二抗（北京中杉金橋）；Trizol and RT－PCR試劑盒（Fermentas）。

1.3 hESCs培養、分化及實驗分組 hESCs復蘇后，接種于絲裂霉素滅活的胚胎鼠成纖維細胞飼養層上，加入hESCs培養基，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，第6～7d機械法傳代。傳代后細胞分為3組：A組細胞序貫加入EB培養基、神經干細胞培養基及神經元培養基常規誘導分化；B組細胞除常規誘導分化外，各階段培養基中分別加入10ng／mL VEGF；C組在 VEGF添加之前1h分別給予5μmol／L SB203580，B、C組VEGF作用48h，撤出后誘導過程同A組。

1.4 細胞免疫熒光觀察各階段細胞標志性抗原表達 4%多聚甲醛固定爬片上生長的細胞，一抗4℃過夜，二抗37℃孵育1h，DAPI復染核。中性樹膠封片，照相。各階段各組細胞隨機取3張爬片，觀察10個視野，陽性細胞率＝陽性細胞數／DAPI復染細胞數。

1.5 半定量RT－PCR檢測 （1）提取總RNA，按trizol試劑說明操作；（2）合成cDNA，采用Fermentas RT試劑盒，按產品說明書操作。（3）聚合酶鏈反應，GAPDH作為參照。（4）采用Lab Works 4.0凝膠成像系統進行成像，Quantity One分析系統進行圖像分析，以（目的基因－背景）／（GAPDH－背景）的積分吸光度比值作為目的基因mRNA的表達水平。

1.6 MTT檢測 （1）VEGF作用48h后的神經干細胞加MTT溶液（濃度為5mg／mL），孵育4h；（2）吸棄上清液，加DMSO振蕩；（3）選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值；（4）以不同干預為橫坐標，各組吸光值／常規組吸光值比值為縱坐標繪制存活細胞曲線。

2 結果

2.1 免疫熒光法檢測γ－分泌酶抑制劑對VEGF在hESCs神經分化各階段的影響 hESCs到EB階段，各組細胞得到的EB數量基本相同，均為60%左右，無明顯差異；經免疫熒光法計數，EB到神經干細胞階段，3組細胞Nestin和MAP2陽性率的比較見表1。

表1 3組細胞Nestin和MAP2陽性率的比較 （%）

2.2 RT－PCR法檢測p38αmRNA在各組誘導得到的神經元中的表達 p38αmRNA在VEGF作用組（B組）表達較強，而在p38MAPK抑制劑預處理的VEGF組（C組）中的表達與常規誘導組接近，見圖1、2。

圖1 3組神經元p38αmRNA半定量分析

圖2 RT－PCR檢測3組神經元p38αmRNA表達

2.3 MTT法結果 VEGF作用組（B組）NSCs的 MTT比值明顯高于常規誘導組（A組），p38MAPK抑制劑預處理的VEGF組（C組）MTT比值則與VEGF作用組（B組）相近，見圖4。

圖33 組神經干細胞MTT比值比較

3 討論

MAPK家族成員是哺乳動物細胞內一組進化保守的酶。近年來發現MAPK家族是連接細胞膜表面受體與決定性基因表達之間的重要信號調節酶，控制著細胞的適應、增殖、分化、存活和凋亡等幾乎所有生理功能和過程，故又有細胞質和細胞核聯系樞紐之稱。p38MAPK是MAPK家族的一個重要組成部分，早期研究認為p38MAPK介導炎性因子和環境應激的細胞反應，最近研究表明p38MAPK參與葡萄糖攝取、核苷酸代謝等更廣泛的細胞功能［3］。下游底物很豐富，包括多種轉錄因子和激酶等，因此引起的生物學效應也多種多樣［4］。有學者報道［5-6］p38MAPK 通路調控某些特殊類型的神經細胞在發育過程中的遷移，并參與了神經元的分化、存活等生理過程，還可以通過影響神經突觸的蛋白質合成以及谷氨酸受體的內吞過程而調控神經元的生理功能。

本實驗應用p38MAPK抑制劑，以了解VEGF在人胚胎干細胞神經分化中的作用與MAPK信號通路有無相關性。研究發現，在人胚胎干細胞生成EB過程中，各組細胞EB生成量無明顯差異，未觀察到VEGF對這一階段胚胎細胞發育的作用，同樣也未發現該階段中VEGF與p38MAPK信號轉導通路的相互影響。在EB向神經干細胞分化過程中，應用p38MAPK抑制劑（C組）后，產生的神經干細胞數量與VEGF組（B組）相似，差異無統計學意義，說明p38 MAPK抑制劑不能拮抗VEGF的促神經干細胞增殖作用，進而表明在人胚胎干細胞經VEGF作用分化為神經干細胞過程中，p38MAPK信號轉導途徑未參與其中。而在NSCs進一步分化為神經細胞過程中，VEGF可以促使神經干細胞更多的向神經元分化，p38MAPK抑制劑預處理的VEGF作用組（C組）與常規誘導組（A組）分化為神經元的比例無明顯差異，未能表現出更多向神經元分化的趨勢，神經元的陽性率遠低于VEGF作用組（B組）。RT－PCR半定量分析顯示，VEGF作用組（B組）神經元的p38αmRNA含量高于p38 MAPK抑制劑預處理的VEGF作用組（C組）與常規誘導組（A組），這提示我們p38MAPK抑制劑抑制了VEGF的促神經干細胞分化為神經元作用，說明VEGF作用的神經干細胞向神經元分化中，p38MAPK信號通路的激活參與其中，但是p38MAPK具體是通過抑制凋亡間接促進神經元生長還是直接促進神經元發生或激活其他通路繼而發揮作用尚需進一步探討。

此外，一些研究發現，血管內皮生長因子對胚胎皮層神經元的神經增殖作用由多種信號途徑介導，包括上調E2F轉錄因子，增加細胞周期G1／S若干關鍵組成部分的表達［7］；也有實驗表明VEGF的促神經生長作用可被磷脂酶C抑制劑U73122等阻斷［8］。故而VEGF發揮促神經增長和分化效應的信號通路是一個復雜過程，具體通路有待于進一步闡述。

［1］焦淑潔，張蘇明.VEGF在人胚胎干細胞向神經元分化中作用的研究［J］.卒中與神經疾病，2009，16（3）：134－137.

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［4］Sato K，Hamanoue M，Takamatsu K.Inhibitors of p38mitogenactivated protein kinase enhance proliferation of mouse neural stem cells［J］.J Neurosci Res，2008，86（10）：2179－2189.

［5］Takeda K，Ichijo H.Neuronal p38MAPK signalling：an emerging regulator of cell fate and function in the nervous system［J］.Genes Cells，2002，7（11）：1099－1111.

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［8］Jung KH，Chu K，Lee ST，et al.Granulocyte colony－stimulating factor stimulates neurogenesis via vascular endothelial growth factor with STAT activation［J］.Brain Res，2006，16：1073－1074.