5－羥色胺轉運體基因多態性與腦卒中后抑郁的關系

曹金霞 耿德勤 姜建東 劉 莉 姜玉龍 孫德錦

1）江蘇連云港第二人民醫院神經內科 連云港 222002 2）徐州醫學院附屬醫院神經內科 徐州 221002

腦卒中后抑郁癥（post－stroke depression，PSD）是腦卒中最常見的并發癥之一，分析顯示占腦卒中患者30%左右，常直接影響患者的生活質量和神經功能康復［1－2］。PSD的發生與中樞5－HT能系統功能障礙關系密切，位于突觸前膜的5－HT轉運體（5－HTT）通過再攝取突觸間隙的5－HT而在5－HT代謝及功能精細調節中起關鍵作用，其編碼基因SCL6A4是抑郁癥分子遺傳研究的焦點［3－6］。現在已知的眾多5－HTT基因多態性中，絕大多數多態性對5－HTT基因的結構和功能表達沒有影響，5－HTT基因5’端啟動子區域上的5－HTTLPR多態性，是一個44個堿基的插入／缺失多態性，是5－HTT基因轉錄調控的主要位點［7］，5－HTTLPR多態性和抑郁癥的關系已被國內外大量研究證實［6］，國外有研究顯示5－HTTLPR多態性與PSD關聯［3－5］，但是目前國內有關于PSD與5－HTT基因多態性的研究非常少［9－10］，如果能找到5－HTT基因多態性和PSD有很好的相關性，那么就可以指導臨床。本研究采用病例－對照研究及關聯分析的方法，在江蘇漢族人群中探討5－HTTLPR多態性與PSD的關系，尋找PSD發病的遺傳易患因素。

1 對象與方法

1.1 對象 系2006－01～2011－06在徐州醫學院附屬醫院和連云港市第二人民醫院神經科住院漢族首次發病的腦卒中患者387例，均符合全國第4屆腦血管病學術會議修訂的診斷標準，并經頭顱CT或MRI確診。入組者均無意識障礙及智能障礙，既往無精神病史。其中符合中國精神障礙分類與診斷標準第3版（CCMD－3）“抑郁癥”診斷標準及入院后第2周、第4周漢密爾頓抑郁量表（HAMD）17項評分＞17分，并持續2周以上者96例歸入PSD組，男39例，女57例；年齡39～70歲，平均（56.9±7.9）歲；腦梗死79例，腦出血17例。291例非PSD患者中隨機選擇97例歸入非PSD對照組，男43例，女54例；年齡40～65歲，平均（55.2±6.0）歲；腦梗死77例，腦出血20例。同時選擇徐州醫學院附屬醫院體檢中心健康體檢者共60例作為正常對照組，男24例，女36例；年齡40～65歲，平均（46.7±5.5）歲。對照組性別、年齡與PSD組相匹配。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取：抽取入組者外周靜脈血5mL，EDTA抗凝，采用常規方法提取DNA（根據TIAN－GEN生化科技（上海）有限公司提供的DNA提取試劑盒說明進行）。

1.2.2 5－HTTLPR多態性檢測：采用聚合酶鏈反應技術，引物設計通過引物設計軟件primer 5.0及參考文獻進行，將通過軟件設計得到的多對引物輸入到美國國立圖書館數據庫的BLAST中（網址：www.ncbi.nlm.nih.gov／blast）進行引物的同源性比較，選出同源性最小而退火溫度（Tm值）合適的引物確定為PCR反應引物，通過大連寶生物有限公司合成。上游引物為5′－GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC－3′，下游引物為5′－GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC－3′。PCR反應體系25μL，dNTPs 200μmol／L，上、下游引物各10pmol／μL，10倍GC緩沖液8μL，TaqDNA聚合酶1U，模板DNA 100ng。反應在PCR擴增儀PT－100型進行。反應條件：95℃預變性5min，95℃變性30s，64℃退火45s，72℃延伸30s，共35個循環，72℃延伸5min。產物檢測用2%瓊脂糖凝膠，80V電壓電泳60min，溴酚藍染色后用凝膠成像儀照相觀察電泳帶型確定基因型。目的基因的片段長度：S：484bp，L：528bp。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件包建立數據庫并進行統計分析。計量資料用均數±標準差（）表示，2組間比較用獨立樣本t檢驗或Mann－Whitney U檢驗，多組間比較用方差分析或非參數檢驗；計數資料用頻數或百分位數表示，吻合度χ2檢驗用于檢驗各組是否符合Hardy－Weinberg（H－W）平衡法則；χ2檢驗用于比較各組間基因型和等位基因頻率的分布，等位基因與PSD的關系采用比值比（OR）估計相對危險度。

2 結果

2.1 基因型 本研究檢測到5－HTTLPR基因多態性的2種等位基因（見圖1）：S等位基因（484bp）、L等位基因（528 bp），3種基因型：SS、LS和LL型。未見到文獻中曾報道的超長L等位基因（572bp或616bp）。

2.2 Hardy－Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗（H－W 平衡）各組基因型均滿足 H－W 平衡（PSD組：χ2＝1.46，P＝0.22；非PSD組：χ2＝0.65，P＝0.42；正常對照組：χ2＝0.93，P＝0.34），表明本實驗所測基因型數據可靠，能代表各群體水平。

2.3 各組5－HTTLPR基因型和等位基因頻率比較 見表1。數據分析結果顯示PSD組和腦卒中后非PSD組以及健康對照組間5－HTTLPR基因型頻率（SS、SL、LL）有顯著差異（χ2＝10.05，P＝0.04），PSD組SS基因型頻率（54.2%）及S等位基因頻率（71.9%）顯著高于腦卒中非PSD組（37.1%，59.3%）和健康對照組（33.1%，55.0%），攜帶 S等位基因者PSD的危險較對照組提高了1.76倍（OR＝1.76，P＜0.01，95%CI：1.15～2.69）。

圖15 －HTTLPR多態位點PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 各組5－HTTLPR基因型及等位基因頻率的比較 ［例（%）］

3 討論

腦卒中后抑郁（post stroke depression，PSD）的發病機制復雜，近幾十年研究并未得出肯定性的結論［1－2］。有研究［1，8］發現抑郁病史及抑郁癥家族史是PSD發生主要預測因素之一，提示PSD存在遺傳易感性，尋找PSD的易感基因成為研究的一個重點［3－5］。5－羥色胺重攝取抑制劑（SSRIs）有效治療PSD，提示PSD也與腦內的5－HT代謝失衡有關。5－HT轉運體（5－HTT）是SSRIs類藥物作用靶點，也是5－HT代謝的關鍵環節，5－HTT功能受5－HTT基因轉錄調控，5－HTT基因也是PSD遺傳學研究的焦點。5－HTT基因5’端啟動子區域上的5－HTTLPR多態性，是5－HTT基因轉錄調控的主要位點［7］，在基因表達水平上影響5－HTT的轉運功能，因而有理由認為5－HTTLPR多態性和PSD可能存在相關性。

本研究結果顯示PSD組5－HTT基因的5－HTTLPR多態性SS基因型頻率及S等位基因頻率顯著高于腦卒中非PSD組和健康對照組，攜帶S等位基因者PSD的危險性提高了1.76倍（OR＝1.76，P＜0.01）。提示5－HTTLPR多態性可能與中國漢族PSD的發病存在一定相關性，SS基因型及S等位基因是中國漢族PSD的危險因子。歐美人群［3－5］和國內［9］研究也提示5－HTTLPR多態性與PSD的發病相關，支持本實驗結果。

根據啟動子區5－HTTLPR多態性將5－HTT基因分為L／L、L／S、S／S3個基因型。在蛋白產物水平上，LL基因型產物的重攝取5－HT能力分別是LS基因型產物、SS基因型產物的1.9倍和2.2倍，“L”等位基因能增強5－HTT基因的轉錄和5－HTT蛋白的表達，從而使5－HT的回吸收率升高，因而認為“L”與“S”在5－HTT基因的轉錄和轉運體蛋白的表達上有不同的功能，從而影響5－HT的生理功能［7］。但5－HTTLPR究竟具體是通過何種途徑來影響5－HTT功能，目前還不清楚，尚需進一步的研究。盡管結論尚不一致，大量研究支持S型等位基因與應激事件后發生抑郁風險相關，SS基因型與應激事件相互作用導致抑郁的發生［6］。

本研究初步探索5－HTTLPR多態性與PSD的關系，為以后繼續進一步研究奠定了基礎。盡管本次研究發現5－HTTLPR多態性與中國漢族PSD之間可能存在一定關聯，但本研究僅涉及多個多態位點中重要的一個，其他位點以及各位點間的相互作用對PSD的影響尚未研究。本研究的樣本量較少，并且缺乏家系資料，未能進行傳遞平衡檢驗，因此更需要在相同或不同人種和地理環境背景下的其他或更大的獨立患者樣本及家系中進行謹慎的重復性試驗來驗證5－HTTLPR多態性與PSD的關系。

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