綿陽麥冬1H-NMR主成分分析暨質量控制研究

江洪波 姜建輝 田仁君 文登福 楊潔

麥冬為百合科植物麥冬[Ophiopogonjaponicus(Thunb.) Ker-Gawl.]的干燥塊根[1]，始載于《神農本草經》，列為上品，為常用中藥之一。綿陽是中國麥冬的主產區之一，但麥冬品種品質復雜，區分綿陽產區各種不同麥冬，找出區分道地綿產麥冬及建立其道地標準有著現實意義。綿陽產麥冬的差異包括：種植區域不同，品種差異，炮制儲藏方法不同，不同的年份等，這種差異會體現在麥冬中所含的化學成分的種類和相對含量的不同。本文通過1H-NMR譜，以中國藥品生物制品檢定所的標準麥冬為參照，對綿產新麥冬特等品、陳年麥冬、硫熏麥冬等的主要化學成分為研究對象，采用主成分分析方法進行比較分析研究。

1 材料與方法

1.1 麥冬樣品的來源

本試驗的麥冬樣品來源如表1所示。FM和MM組是原產綿陽，后移種于彭洲，FM為正宗O.japonicus(Thunb.) Ker-Gawl.，而MM則為一新變種O.japonicus(Thunb.)Ker.Gawl.cv.Mianyangensis；MD組采于2007年四川綿陽；H組采于2009年綿陽花園鎮，H-5、H-6、H-27均為顆粒飽滿的特級品，且未被硫熏過，H-18為一級品，顆粒較小；G組采于2009年綿陽光明鎮，且均被硫熏過。

表1 麥冬樣品來源

1.2 儀器和試劑

Sartorius BS 224 s電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；SENCOR-201旋轉蒸發器儀；W201D恒溫水浴鍋(上海申順生物科技有限公司)；Bruker AV II-600核磁共振儀； 氘代二甲亞砜-d6(DMSO-d6)(ARMAR chemicals)；分析純甲醇。

數據分析軟件：Mestre-C；Excel；SIMCA-P 11.0。

1.3 方法

稱取剪碎的麥冬樣品2 g，加入甲醇(每次20 ml)，50℃水浴溫浸提取三次，每次1小時；合并濾液，減壓濃縮至干。稱取0.05 g提取物，用0.5 ml DMSO-d6溶解，制得供1H-NMR譜測定樣品溶液。測定獲得的各樣品的自由衰減(FID)信號，導入MestRe-C軟件，以每0.01化學位移值單位對各樣品1H-NMR圖譜進行分段積分，即得到每個樣本的各化學位移值段與相對應的信號峰面積積分值(每張圖譜共有約1000積分值)。本試驗共26個樣本，即構成26×1000數據矩陣，然后用SIMCA-P 11.0軟件分析。

1.4 分析測試方法的考察

參照《中國藥典》2005年版一部附錄ⅩⅧA 《中藥質量標準分析方法驗證指導原則》的要求，本試驗采用夾角余弦[2]作為判斷指標。

樣品制備方法重現性考察：取標準麥冬5份 ，按1.3項下方法分別制備 5 份供試液，測定1H-NMR圖譜，得到5組積分值數據。以第一份樣品的數據為對照，計算5份樣品之間的夾角余弦值分別為1.000、0.9993、0.9995、0.9989、0.9994。計算值均為0.998以上，說明該實驗所用樣品制備方法具有良好的重現性。

核磁共振儀穩定性及圖譜處理方法重現性考察：取標準麥冬1份，按 1.3項下方法制備供試液，連續測定5次，得到5組數據。以第一組測定數據為對照，計算5組數據之間的夾角余弦值分別為1.000、0.9996、0.9992、0.9995、0.9994。計算值均在0.999以上，說明該實驗所用核磁共振儀穩定性以及圖譜處理方法重現性良好。

2 結果與分析

通過SIMCA-P 11.0進行主成分分析，由軟件根據規則計算所得，選取了主成分1，2，3，它們分別代表了麥冬樣品信息含量的40.17%，17.55%，11.44%，也就是全部1H-NMR圖譜信息的70%，可以基本反應麥冬甲醇提取物的內在化學成分種類和相對含量的信息。主成分分析結果的不同，將是不同麥冬內在化學成分種類和相對含量的差異的體現。

2.1 主成分1和主成分2的分析圖譜

從主成分1和主成分2的分析圖譜(圖1)可以看到樣品主要聚集三個區域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。在區域Ⅰ內是標準麥冬BM組、09年綿陽花園鎮麥冬H組、07年麥冬MD組和涪麥冬FM組中的一部分。這說明它們之間有很大的相似性(均為同一個品種)，但MD、H、BM和FM組之間在區域Ⅰ內仍可區分，說明它們之間也有一定差異，這個可能和它們的產地及年份不同有關。BM產于江浙，FM產自彭洲，H和MD產于綿陽。H組和MD組雖然品種、產地均相同，但年份不同，H是09年樣品，而MD是07年樣品。

區域Ⅱ內的是MM組和部分G組，說明主成分1和2包含的這兩組信息相似性很大。MM和區域Ⅰ內的樣品不是同一個品種，所以很容易區分解釋。而G組的G-11和G-12是經過硫熏過的樣品也可以區分和解釋。而區域Ⅲ中的樣品可能是由于其它的原因和區域Ⅰ、Ⅱ有顯著差異，說明主成分1和2包含的信息顯著區別于區域Ⅰ、Ⅱ內的樣品，至于是哪些具體的化學成分和含量的差異有待進一步研究。

主成分1和2所包含的信息量可以將同一來源的品種較好的聚集在一起，也就是它們所含的化學成分種類和含量有一定的相似性，如BM(1，2，3，4，5)、MD(2，3，4，5)、FM(1，2，4)、MM(1，2，3，5)、G(11.12)、H(5，6，27)等。MM-3在Ⅰ區， MD-1在Ⅱ區，表明同一來源的樣品中也有一些品質相差較大的樣品。

圖1 主成分1和主成分2分析圖譜

2.2 主成分1和主成分3的分析圖譜

從主成分1和主成分3的分析圖譜(圖2)可以看到樣品被分為了上下兩個大的部分(虛線)，上面A部分均是樣品采集較早的麥冬，而下面B部分均來自09年的綿陽麥冬，即主成分3可以區分樣品的新陳。在B區域還可以看到，09年產綿陽麥冬，沒有經過硫熏，且顆粒飽滿的特等品H-5、H-6和H-27聚集在一起，能顯著區別于硫熏過的G組，而H-18在G組區域，說明H-18很有可能被硫熏過。

主成分1和3所包含的信息量同樣可以將同一來源的品種較好的聚集在一起，而且區分度更好，如BM(1，2，3，4，5)、MD(2，3，4，5)、FM(1，2，4)、MM(1，2，3，5)、H(5，6，27)聚集度更加集中。主成分1和3可以區別出樣品年代和是否被硫熏過。

圖2 主成分1和主成分3分析圖譜

3 討論

通過以上分析可知，可以通過麥冬1H-NMR-PCA模式識別的方法把綿陽產麥冬和其它地區的麥冬進行區分，可以將不同品種的綿陽麥冬進行區分，可以將是否經過硫熏的麥冬區分出來。因為不同品種、不同產地、不同年代、不同炮制方法得到的麥冬，它們的內在化學成分的種類和相對含量必然存在著差異，至于是什么具體的化學成分導致這些差異，還有待進一步研究。

在主成分1和3分析圖譜中，H-5、H-6和H-27三個樣品聚集區顯著區別于其它樣品(圖2)，如果以H-5、H-6和H-27特級品為綿陽道地麥冬的標準品，通過1H-NMR主成分分析-模式識別的方法就可以在一定程度上保證綿陽麥冬的道地性，是麥冬內在質量(化學成分種類和含量)控制的一種有效手段。

1H-NMR圖譜理論上可以提供樣品中所有含氫有機化合物的信息，所以可以較為全面的反應中藥提取物中的化學成分和相對含量。主成分分析法(PCA)能從1H-NMR譜大量二維數據中獲得具有統計學意義，綜合的化學成分信息，PCA方法是最簡單、最常用且比較有效的無監督方法 ，其原理是通過線性變換 ，將原來的多變量組合成相互獨立的少數幾個能充分反映原有變量信息的新變量 ，從而在不丟掉主要信息的前提下避開了變量間共線性的問題 ，便于結果做進一步的分析[3]。這種方法可以嘗試著于各地各種道地藥材，以控制道地藥材的質量。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部)[S].中國醫藥科技出版社， 2005：20，122.

[2] 王龍星， 肖紅斌， 梁鑫淼，等.一種評價中藥色譜指紋譜相似性的新方法：向量夾角法[J]. 藥學學報， 2002 ， 37 (9) ：713-717.

[3] 譚小燕，羅喬奇，馬鄭紅，等. 不同產地麥冬1H-NMR模式識別研究[J]. 中草藥，2009，40(5)：792-797.