植酸酶耐熱性評價方法的研究

馬俊孝 盧彥梅 劉 偉 張贊劍 史衍魯

植酸酶是一種能水解植酸的酶類，在提高飼料中磷的利用率、減少糞便中有機磷的排放以及降低飼料成本方面的效果已被廣泛證實[1－2]。與所有的酶制劑一樣，植酸酶對溫度、酸堿、水分及貯存等環(huán)境因素很敏感，尤其是溫度、水分對酶活性有很大的影響。畜禽飼料生產(chǎn)過程中的制粒、膨化、擠壓調(diào)質(zhì)等工序，溫度一般在70～95℃，會嚴重破壞酶的活性，從而限制酶使用。采用的微丸包被技術(shù)生產(chǎn)植酸酶是解決這個問題的一個現(xiàn)實、有效的方法。

市場上已有幾種微丸型的耐高溫植酸酶產(chǎn)品，但這種耐高溫植酸酶對飼料制粒過程的耐受性能仍然是最受關(guān)注的焦點。如何比較不同的耐高溫植酸酶從而選擇合適的產(chǎn)品是困擾使用者的難題。因此，有必要建立一種快速、簡易的方法，有效評價飼料加工過程中植酸酶活性的損失情況具有重要的應(yīng)用價值。本文比較了幾種實驗室條件下評價植酸酶耐熱性的方法，并結(jié)合飼料制粒試驗，提出了一種簡單、快速并接近飼料加工過程中酶活損失情況的植酸酶耐熱性評價方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

耐高溫植酸酶為收集自國內(nèi)市場上常見的幾種產(chǎn)品。

1.2 酶活力檢測

植酸酶產(chǎn)品的酶活檢測參照國家標準GB/T 18634—2009，采用分光光度法測定 [GB/T 18634—2009《飼用植酸酶活性的測定——分光光度法》]。酶活力定義為：樣品在植酸鈉濃度為5.0 mmol/l、溫度為37℃、pH值為5.0的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1 μmol無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U/ml（或U/g）表示。

飼料試驗樣品中植酸酶的酶活按照劉玉慶等[3]所述方法進行檢測。

1.3 實驗室條件下植酸酶的耐熱性評價

水浴法：準確稱取0.2000 g樣品，用少量緩沖液轉(zhuǎn)移到50 ml容量瓶中，定容，磁力攪拌條件下浸提30 min，取上清液進一步稀釋，使稀釋液酶活在20～30 U/ml左右，取上述稀釋液10 ml置于80℃的水浴中處理5 min、10 min，取出自然冷卻，測定處理后溶液中植酸酶活性。

干熱法：準確稱取0.2000 g樣品于200 ml燒杯中，置于80℃電熱恒溫鼓風干燥箱中熱處理10 min，取出自然冷卻后，測定熱處理前后樣品的酶活。

濕熱法：準確稱取0.2000 g樣品放入200 ml燒杯中，置于手提式高壓蒸汽消毒器內(nèi)，蓋上蓋，用飽和水蒸汽處理2 min或更長時間（蒸汽溫度從初始的99℃至結(jié)束時的110℃），取出后自然冷卻，分別測定處理前后的酶活。用蒸汽處理酶樣品時要防止冷凝水滴入燒杯中。

植酸酶的耐熱性能以酶活的殘存率來表述，以處理后與處理前植酸酶樣品的酶活比值(%)來表示，所有數(shù)據(jù)均為3次測定結(jié)果的平均值。

1.4 飼料加工過程對酶活力的影響

耐高溫植酸酶的飼料中制粒試驗在山東六和集團的不同飼料廠進行，飼料品種為肉中雞全價配合飼料511，主要飼料加工參數(shù)為：調(diào)制時間18～30 s，調(diào)制溫度70～80℃，蒸汽壓力0.4～0.5 MPa。試驗中除去初始和結(jié)尾階段的料，在生產(chǎn)線上均勻間隔地分別采集混合及成品各12個樣本進行測定，取12個測定值的平均值。植酸酶的耐熱性能以成品顆粒飼料中酶活與飼料生產(chǎn)前的混合原料中酶活的比值來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同評價方法對植酸酶耐熱性的影響

收集市場上常見的2種耐高溫植酸酶產(chǎn)品，根據(jù)已報道的文獻，用實驗室方法及實際飼料制粒試驗以考察耐高溫植酸酶的酶活力殘留情況，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，用不同的評價方法考察同一個植酸酶的耐熱性時結(jié)果相差非常大，水浴法評價條件下酶活損失最多，而干熱條件下酶的損失很少，濕熱法的結(jié)果介于水浴法和干熱法之間。幾種實驗室評價方法中，濕熱法與實際飼料制粒試驗結(jié)果最為接近。

表1 不同評價方法下植酸酶的耐熱性(%)

2.2 濕熱法處理時間的優(yōu)化

表1中，濕熱法處理后的酶活損失最接近于實際飼料制粒后的酶活損失情況，可以用濕熱法進行實驗室條件下植酸酶的耐熱性評價。但是，濕熱法與實際飼料制粒情況有一定的偏差。因此，對濕熱法處理時間作適當延長。選擇3種自制的微丸型耐高溫植酸酶樣品，用濕熱處理不同時間，酶的耐熱性結(jié)果如表2所示。表2中，濕熱處理2 min時，3個酶樣品的耐熱性差別不大，而濕熱處理2.5 min時耐熱性大幅降低，而且3個樣品的耐熱性顯示了較明顯的差異，同時濕熱處理2.5 min耐熱性評價結(jié)果與飼料制粒試驗結(jié)果更加接近。

表2 濕熱法處理不同時間下植酸酶的耐熱性表現(xiàn)(%)

然而，在嚴格條件下進行飼料制粒時，濕熱評估法需要再次延長蒸汽處理時間。筆者選擇自制的包衣微丸型植酸酶樣品F、G、H以及I，用濕熱法進行耐熱性能的評價，結(jié)果如表3所示。

表3 濕熱法處理不同時間下植酸酶的耐熱性表現(xiàn)(%)

由表3可知，調(diào)質(zhì)溫度更高（80℃）、調(diào)質(zhì)時間更長（30 s）、蒸汽壓力更大（0.5 MPa）的飼料加工過程，對酶的損傷更大，因此，在所述試驗條件下，濕熱法3 min的處理結(jié)果更接近于飼料加工過程中酶活損失的實際情況。

3 討論

隨著飼料廠越來越多地采用高溫短時加工設(shè)備，如制粒機、膨化機、深度調(diào)質(zhì)器以及通用熟化制粒機等，飼料中的酶制劑等熱敏性組分受到不同程度的破壞。改進熱敏性添加劑的生產(chǎn)和使用工藝成為近年來添加劑和飼料工業(yè)的一項重要工作，目前，通過提高植酸酶的添加量來彌補因酶活力損失造成的有效值不足，或通過微丸包被技術(shù)、基因工程方法改良發(fā)酵菌株等手段，一定程度上減輕了飼料加工過程對酶的損害。盡管如此，高溫、高濕的飼料加工環(huán)境對植酸酶活性仍然有不可避免的影響，有效評價飼料加工過程中植酸酶活性的損失具有重要的應(yīng)用價值。

目前，實驗室條件下評價植酸酶熱穩(wěn)定性常用的方法有干熱法、水浴法和濕熱法。干熱法是將植酸酶置于干燥箱中，然后在一定的溫度下處理一定時間，測定植酸酶活性損失的方法。已有的實踐表明，由于沒有水分因素的影響，大多數(shù)植酸酶對干熱環(huán)境都有較好的耐受性，干熱法對酶的耐熱性評估結(jié)果遠比實際飼料制粒結(jié)果要高。本試驗中干熱條件下酶活損失只有5%左右，與其他研究者的報道類似[4－5]。

水浴法是在水浴鍋中對植酸酶溶液在一定溫度下進行水浴保溫來評估酶的耐熱性能，所得到的酶活殘留率要比實際值低得多。水浴法將酶樣品溶解在水溶液中，使酶蛋白完全暴露在較高溫度的水環(huán)境中，實際是在評價酶蛋白的耐熱性能，而不是酶產(chǎn)品的耐熱性，因此水浴法對包衣和未包衣植酸酶產(chǎn)品的評估差異較大，與飼料加工過程中酶的實際損失相差甚遠。本研究中，樣品A是包衣產(chǎn)品，水浴法檢測時幾乎沒有耐熱性，然而實際耐熱性達67%，而未包衣的樣品B卻相反（見表1）。

濕熱法在干熱法基礎(chǔ)上加入濕度的因素，使其更接近實際的飼料調(diào)質(zhì)和制粒情況。已報道的濕熱法一般需先測定植酸酶樣品中水分含量，然后據(jù)其水分含量均勻添加純化水調(diào)節(jié)待處理樣品水分至17%左右（飼料調(diào)質(zhì)時的水分含量一般在16%～18%），再置于恒溫箱或水浴中處理一定時間[4,6]。這種評估結(jié)果能很好地反映飼料在實際加工過程中酶活損失的情況。但是，在含有一定水分的酶樣品（一般水分低于8%）中均勻、準確地添加水分至17%，這個試驗操作是一個難題。因此，這種濕熱法雖然有效但不是一種簡單、快捷的評估手段。文中所述濕熱法在蒸汽消毒器中進行濕熱處理，操作簡單、快捷，而且檢測的重復(fù)性好，是一種相對有效的實驗室植酸酶熱穩(wěn)定性的評價方法。

不同飼料廠由于設(shè)備、飼料配方、加工工藝等的差異，飼料制粒過程中的調(diào)質(zhì)溫度、調(diào)制時間、蒸汽壓力、環(huán)模孔徑等參數(shù)有較大的差異。對于某一種植酸酶的耐熱性評價，需要針對不同的飼料調(diào)質(zhì)、制粒參數(shù)，在濕熱蒸汽處理時間上要做出適當調(diào)質(zhì)，使評估方法更接近于特定飼料廠生產(chǎn)的實際。顯然，對于比較不同植酸酶之間耐熱性能的優(yōu)劣而言，從筆者在不同飼料廠的試驗結(jié)果來看，相同條件下濕熱蒸汽處理2.5～3 min能得出各個植酸酶的耐熱性差別，并且與飼料生產(chǎn)的實際酶活損失情況較為接近。

[1]陳琳,王恬.植酸酶對櫻桃谷肉雞能量、蛋白質(zhì)和氨基酸利用率及消化酶活性的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2009,21(6):938－944.

[2]趙春,朱忠珂,李勤凡,等.不同劑型植酸酶對肉雞生長性能和鈣、磷利用率的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2007,19(6):714－718.

[3]劉玉慶,王海,孟慶賀.液態(tài)植酸酶后噴涂工藝設(shè)備及其產(chǎn)品均勻度測定[J].飼料工業(yè),2007,28(15):12－14.

[4]張常明,左建軍,葉慧,等.植酸酶耐熱性評價方法的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2008(2):53－55.

[5]蘇東海,劉萍,鄭亞安,等.包被工藝條件對植酸酶熱穩(wěn)定性的影響[J].生物加工過程,2004,2(3):40－45.

[6]蘇俊兵,王永成.耐高溫植酸酶的發(fā)展現(xiàn)狀[J].中國飼料添加劑,2011(5):13－15.