菌酶協同制備菜籽肽工藝的優化及其營養成分分析

姚曉紅 吳逸飛 王新 孫宏 錢彬 張博 湯江武

我國是菜籽粕產量居世界第一的國家，每年產量可達近千萬噸。菜籽粕營養豐富，粗蛋白含量達35%～45%，同時含有較豐富的Ca、Mg、P、Se及多種營養物質，其中Se含量在植物性蛋白中含量最高[1]。菜籽蛋白幾乎不存在限制性氨基酸，且其氨基酸組成接近聯合國糧農組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）推薦值，是優良的天然植物蛋白資源[2]。但由于菜籽粕中含有硫代葡萄糖苷（硫苷）、植酸等抗營養物質[3]，降低了蛋白質（氨基酸）的消化利用率，極大地限制了其在畜禽日糧中的應用。

國內外學者曾采用微生物發酵法對菜籽粕進行脫毒，取得了顯著效果；同時研究還發現，菜籽蛋白經微生物降解后可得到低分子量的菜籽肽。菜籽肽具有低抗原性、酸溶性、低黏度等特點，且在體內消化吸收快，能有效提高菜籽蛋白利用率[4]。目前，單一依靠微生物發酵所得菜籽肽含量較少。因此，本研究在前期獲得優良脫毒菌株及最佳脫毒工藝的基礎上，以菜籽蛋白降解為目標，嘗試在微生物發酵脫毒的基礎上添加中性蛋白酶，進行菌酶協同酵解工藝研究，以期擴大菜籽肽得率，為進一步提高菜籽粕的利用率提供支持。

1.材料與方法

1.1 原料及菌種

菜籽粕購自紹興中大飼料有限公司，粗蛋白含量≥32%，硫苷含量≥35 μmol/g；中性蛋白酶購自Sigma 公司，酶活 500 U/mg；枯草芽孢桿菌 B1（Bacillus subtilis－B1）為本實驗室篩選獲得的高效硫苷降解菌，于－4℃保藏于斜面培養基。

1.2 培養基

斜面培養基：牛肉膏 5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂 2%，pH 值 7.0～7.2，H2O 1000 ml。

液體培養基：不加瓊脂，其余成分與斜面培養基相同。

固態發酵培養基：菜籽粕100%、料水比1：1，pH值自然。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

無菌條件下接一環斜面菌種B1于液體培養基中，于37℃、200 r/min培養20 h，菌體濃度達108CFU/ml。

1.3.2 菜籽粕菌酶酵解的方法

稱取100 g新鮮菜粕，加入100 ml H2O，按2%（菜籽粕干料重）的接種量、100 U/g(菜籽粕干料重)的加酶量加入活化液體菌液、中性蛋白酶（具體接種和加酶的方式見表1)，混合均勻，裝入500 ml罐頭瓶中，用無菌報紙封口，置于30℃培養48 h，分別在試驗設定時間取出，50℃烘干至恒重，粉碎過80目篩待測。

1.3.3 單因素試驗

設計4種不同的菌酶發酵菜粕方式（見表1）。以硫苷降解和肽含量為指標，在獲得的最佳發酵方式下，以肽含量為指標，分別進行不同B1接種量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、不同酶添加量(50、100、150、200、250 U/g) 和不同料水比（1：0.8、1： 0.9、1： 1.0、1： 1.1、1：1.2）的單因素試驗。

表1 菌酶發酵菜粕方式

1.3.4 正交試驗

發酵工藝優化采用3因素3水平L9（33）正交試驗，共設9個處理，每個處理3個重復，各參數水平根據單因素試驗結果，選擇接種量、酶添加量、料水比3個因素進行正交試驗，隨后篩選出優化組合。

1.3.5 檢測方法

硫苷含量檢測采用氯化鈀分光光度法[5]；硫苷分解產物異硫氰酸酯(ITC)和噁唑烷硫酮(OZT)含量檢測參照國家標準 GB 13087—91 GB 13089—91[6－7]；單寧含量檢測參照國家標準GB/T 15686—2008[8]；植酸含量檢測采用分光光度法[9]；粗蛋白含量檢測采用凱氏定氮法[10]；菜籽肽含量檢測：稱取過80目篩的待測樣品，加入等體積10%三氯乙酸(TCA)，在160 r/min下振蕩30 min，而后4000 r/min離心15 min，取上清液采用Folin－酚法[11]測定蛋白質總量；菜粕蛋白分布采用SDS－PAGE凝膠電泳[12]；還原糖含量檢測采用DNS分光光度法[11]；鈣含量檢測參照[13]GB/T 13885—2003，磷含量檢測參照[14]GB/T 6437—2002。

1.4 數據統計分析

數據采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理和方差分析,多重比較采用LSD法，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 菌酶協同酵解菜粕方式的確定(見表2)

表2 發酵方式對菜籽肽和硫苷含量的影響

由表2可知，處理方式3，即菌酶同步發酵，在菜籽肽含量提高和硫苷降解方面，同時取得較好的效果，硫苷降解率達到68.10%，菜籽肽含量為140.78 mg/g，比發酵前提高了3.21倍。而處理4，即菌酶分步發酵方式，雖然菜籽肽含量的提高效果明顯，但硫苷降解效果較差。因此，選擇菌酶同步添加的方式進行協同酵解后續的單因素試驗。

2.2 菌酶協同酵解條件研究

2.2.1 接種量對菜籽肽含量的影響(見圖1)

圖1 接種量對菜籽肽含量的影響

隨著接種量的增加，菜籽肽含量呈現先增加、后下降的變化過程。當接種量為1.5%時，菜籽肽含量達156.4 mg/g，接種量為2%時，菜籽肽含量達164.3 mg/g，增加幅度不大，因此本試驗選擇適宜接種量為1.5%。

2.2.2 酶添加量對菜籽肽含量的影響(見圖2)

圖2表明，當中性蛋白酶添加量為100 U/g時，菜籽肽含量達到161.2 mg/g；當酶添加量為250 U/g時，菜籽肽含量最高，達166.4 mg/g，與添加100 U/g相比，增加幅度不大，考慮到加酶成本，本試驗確定酶的適宜添加量為100 U/g。

圖2 酶添加量對菜籽肽含量的影響

2.2.3 料水比對菜籽肽含量的影響(見圖3)

圖3 料水比對菜籽肽含量的影響

結果表明，隨著發酵體系中水分含量的增加，菜籽肽含量呈逐漸增加的趨勢，但考慮到含水率增加時，會顯著影響到硫苷的脫毒效果，而料水比在1：1、1：1.1和1：1.2時，對菜籽肽含量的影響不大，因此確定最適料水比為1：1。

2.2.4 菌酶協同酵解條件的正交試驗

以菜籽肽含量為指標，選取接種量、酶添加量和料水比進行3因素3水平正交試驗試驗，因素水平編碼表和設計實施方案見表3。試驗結果及方差分析見表4和表5。

表3 正交試驗因素水平

正交試驗的結果顯示，接種量、酶添加量和料水比3個因素中，酶添加量和接種量是影響小肽含量的顯著因素。3個因素對小肽含量的影響，依次為酶添加量>接種量>料水比。根據正交試驗結果確定的最佳發酵條件為：接種量為1.0%，酶添加量為150 U/g，料水比為1：1.0。

表4 菌酶協同酵解正交試驗設計及結果

表5 菌酶協同酵解正交試驗的方差分析

2.3 菌酶協同酵解菜粕營養成分分析

根據正交試驗得到的最佳條件，進行菌酶協同酵解菜籽粕，并對處理前后的菜籽粕進行了營養成分分析和蛋白凝膠電泳，結果見表6和圖4。

表6 菜粕發酵后抗營養因子含量和營養成分分析

表6結果表明，經菌酶協同酵解后，菜粕中硫苷的含量為9.71 μmol/g，降解率達74.23%，其分解產物異硫氰酸酯（ITC）和噁唑烷硫酮（OZT）的含量分別比發酵前降低了79.07%和55.56%；發酵后菜粕中單寧和植酸含量分別降低了31.17%和16.39%；發酵后菜粕樣品中粗蛋白含量達41.30%，比發酵前提高1.92%，菜籽肽含量達170.12 mg/g，比發酵前提高了3.7倍，還原糖含量達14.68%，比發酵前提高了57.68%，發酵后鈣、磷含量分別達1.04%和1.35%，分別比發酵前提高了26.83%和11.57%。

圖4 發酵菜粕樣品的SDS-PAGE電泳圖

SDS-PAGE電泳結果顯示（見圖4），與原菜粕相比較，菌酶協同酵解工藝處理后，菜籽蛋白的大分子量亞基均有不同程度降解，且高于25 kD的高分子肽鏈降解比較完全，另外，14.4 kD以下的蛋白條帶已不存在，說明這些蛋白也被降解為分子量更小的蛋白了。

3 討論

菜籽粕中存在較多的抗營養因子，其中硫苷是最主要的抗營養因子，其含量較高。物理法和化學法脫毒存在耗能高、蛋白損失大、成本昂貴[15-17]等缺陷限制了其使用，微生物發酵法脫毒因其在很多方面能克服物理和化學法的缺點而受到普遍的重視和應用。本試驗中，采用微生物發酵協同酶解處理后，菜籽粕中硫苷的降解率達74.23%，與黃茜等[18]利用篩選獲得的枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和釀酒酵母進行菜粕發酵，得到硫苷的降解率達到89.06%的結果一致。同時，試驗還表明，通過發酵可提高菜籽粕中的粗蛋白含量。劉軍等[19]從土壤中分離出若干霉菌、酵母菌和細菌，對其中3支菌株混合發酵，結果菜粕的粗蛋白含量提高了23%；國外Adarsh Palvig[20]利用少孢根霉發酵菜籽餅粕也發現蛋白含量得到增加。試驗證實了微生物發酵是改良菜籽粕的有效手段。

目前，對植物源蛋白及活性肽的研究日益成為食品、醫藥及飼料等領域的熱點。本試驗中小肽含量比發酵前提高了3.7倍，菜籽粕中還原糖、Ca、P含量分別比發酵前提高了57.68%、26.83%和11.57%。同時SDS-PAGE蛋白凝膠電泳結果也表明，菜粕經菌酶協同酵解后，蛋白組分中高于25 kD的大分子蛋白得到了較充分的降解。據報道，用蛋白酶酶解制備菜籽肽，可得到分子量較小的小肽，且蛋白水解度較高[21-22]。但作為飼料添加劑生產成本太高，同時酶解法對植物源蛋白中抗營養因子的去除效果并不理想。采用菌酶協同酵解法制備菜籽肽，枯草芽孢桿菌能分解其中的抗營養因子作為營養物質供自身的生長，從而達到脫毒的效果，同時外源蛋白酶與微生物發酵產生的酶，將大分子量的蛋白降解為小分子量的蛋白肽，可有效提高菜粕的品質及蛋白利用率，為菜籽粕的深入開發提供新的途徑。

4 結論

本試驗對菌酶協同酵解生產高品質菜粕的發酵工藝進行了研究，通過單因素及正交試驗，確定了采用枯草芽孢桿菌與中性蛋白酶同步發酵的方式，當接種量為1.0%，酶添加量為150 U/g，料水比為1：1.0，發酵溫度為35℃，發酵時間為48 h時，菜籽粕中硫代葡萄糖苷（硫苷）的降解率達74.23%，其分解產物異硫氰酸酯（ITC）和噁唑烷硫酮（OZT）的含量分別比發酵前降低了79.07%和55.56%；發酵后菜粕中單寧和植酸含量分別降低了31.17%和16.39%；發酵后菜籽粕中粗蛋白含量達41.30%，比發酵前提高1.92%，菜籽肽含量達170.12 mg/g，比發酵前提高了3.7倍，還原糖含量比發酵前提高了57.68%，鈣、磷含量分別比發酵前提高了26.83%和11.57%。同時，SDS-PAGE電泳結果表明，菌酶協同酵解工藝處理后，菜籽蛋白中大分子量亞基均得到較好的降解效果。

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