止痢草提取物對患病羅非魚組織器官的影響

葉金明 金立志 鄭宗林

植物提取物是芳香、揮發性化合物的混合物，根據植物材料的芳香特性而命名并由這些植物提取獲得。止痢草（牛至）植物提取物（香芹酚和百里香酚）、肉桂植物提取物（肉桂醛）、麝香草屬植物提取物（麝香草酚）和蕓香料灌木提取物（甲基紫羅蘭酮）等4種植物提取物的純化成分已有較多研究和報道，很多研究報道了肉桂屬、麝香草屬和止痢草植物提取物具有廣泛的體外抗微生物活性。揭示了植物提取物主要成分的體外抗微生物活性是源于植物精油的活性作用。金立志（2007）綜述了一些植物提取物的研究及應用情況。在抗菌方面，止痢草提取物抗菌能力較強，特別是止痢草提取物性質穩定易于使用。但對于止痢草提取物在水產動物中抗菌性能的研究還未見報道。嗜水氣單胞菌是淡水魚流行性敗血癥的主要致病菌。本試驗對羅非魚進行嗜水氣單胞菌攻毒，同時飼料中拌喂止痢草提取物，通過組織切片和電鏡觀察等手段觀察感染嗜水氣單胞菌的羅非魚組織器官的病變情況，及止痢草提取物對組織器官的保護、抗菌性能。

1 材料與方法

1.1 試驗條件

1.1.1 試驗設計

試驗用吉富品系尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）購自重慶市銅梁縣溫泉漁場。試驗開始前停飼24 h，選擇體重接近（22.0±1.0）g的幼魚 90尾，隨機分配于9個養殖缸，具體分組見表1。

表1 試驗設計

1.1.2 試驗飼料

采用羅非魚常規商業配方，具體日糧配方及營養水平見表2。

1.1.3 注射感染

各組投喂相應的飼料3周后，以腹腔注射的方式使羅非魚感染嗜水氣單胞菌。試驗菌株取自上海海洋大學國家水生動植物病原庫，菌株號：ST 78－3－3。將嗜水氣單胞菌涂布于營養瓊脂上，28℃下培養過夜，以制備菌懸液。梯度稀釋制備菌懸液：用0.9%的無菌生理鹽水將嗜水氣單胞菌從營養瓊脂平板上洗下菌落，采用活菌直接鏡檢計數法計菌數，推算出菌懸液的活菌數，并將上述懸液稀釋得到107cfu/ml。陰性對照組每尾魚注射0.1 ml無菌生理鹽水，陽性對照組、OS組每尾魚注射0.1 ml的菌懸液（107cfu/ml）。注射后168 h取陽性對照組和OS組病癥明顯、但未死亡的羅非魚，及從陰性對照組隨機取魚，分離各組織器官固定，每組取3尾。

表2 羅非魚基礎飼料配方及營養水平(%)

1.2 主要試劑與器材

1.2.1 Bouin's固定液

飽和苦味酸水溶液75 ml、福爾馬林25 ml和冰醋酸5 ml混合均勻保存于陰暗處。

1.2.2 Ehrlich氏蘇木精染色液

混合50 ml純酒精與5 ml冰醋酸，然后將1 g蘇木精溶解其中，并加入50 ml甘油。另將5 g鉀明礬（硫酸鋁鉀）加入50 ml蒸餾水內加熱使其溶解，再慢慢傾入上述已配制的混合液，隨之攪拌。過濾后靜置2～4周后尚能成熟，也可加入雙氧水以縮短成熟的時間。

1.2.3 伊紅染色液

0.5g固體伊紅溶解在100 ml 95%的酒精中，加熱后磁力攪拌器攪拌使其充分溶解。

1.2.4 0.1 M磷酸鹽緩沖溶液(PBS)pH值7.3（sorensen配方）

A液為0.2 M磷酸二氫鈉水溶液(27.6 g NaH2PO4·H2O或31.21 g NaH2PO4·2H2O溶于1000 ml雙蒸水)；B液為0.2 M磷酸氫二鈉水溶液（35.61 g Na2HPO4·2H2O 或71.64 g Na2HPO4·12H2O溶于1000 ml雙蒸水)。A液與B液按23：67體積比例混合。

1.2.5 二甲砷酸鹽緩沖液

A 液（0.4 M 二甲砷酸鈉貯存液）：Na(CH3)2·AsO2·3H2O 8.65 g溶于1000 ml雙蒸水。

B液（0.2 M 鹽酸溶液）：HCl(36%～38%)1 ml，加雙蒸水到60 ml。

取25 ml A液、3～4 ml B液混合，測pH值，可用B液調pH值到7.3左右，再加雙蒸水到50 ml，配成的二甲砷酸鈉濃度為0.2 M。最后配成的固定液中加入1～3 mM的鈣離子，可使結構保存更好。

1.2.6 Palade醋酸—巴比妥緩沖液（Palade配方）

A液（巴比妥鈉2.89 g、無水醋酸鈉1.15 g溶解于100 ml雙蒸水中）；B 液[HCl(36%～38%)8.6 ml，加雙蒸水到1000 ml]。臨用時按下列比例混合：A液5 ml、B液5 ml(調整B液的量可得到所需的pH值)、雙蒸水15 ml。

1.2.7 2%鋨酸（四氧化鋨）固定液貯存液的配制

先將4只裝有四氧化鋨的安瓿（共2 g）用肥皂水洗凈，再用洗潔液浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用玻璃劃割器在上面劃痕，再用蒸餾水沖洗幾次，放入潔凈棕色廣口玻璃瓶內，加上100 ml雙蒸水，用潔凈玻璃棒搗破安瓿，或用力搖破。然后用蠟嚴密封口，貼上標簽備用。洗凈后的安瓿嚴禁與手或紗布、濾紙等接觸。將配好的2%四氧化鋨置于干燥器中，于4℃保存。

1.2.8 磷酸緩沖的四氧化鋨固定液的配制

等量的0.1 M磷酸緩沖液（pH值7.3）與2%四氧化鋨貯存液混合，臨用時現配。

1.2.9 二甲砷酸鹽緩沖的四氧化鋨固定液的配制

等量的0.2 M二甲砷酸鹽緩沖液(pH值7.3）與2%四氧化鋨貯存液混合，臨用時現配。

1.2.10 Palade醋酸—巴比妥鈉緩沖的四氧化鋨固定液的配制

取Palade醋酸—巴比妥鈉緩沖5.0 ml與12.5 ml的2%四氧化鋨貯存液混合，再分別加入0.1 M的鹽酸5.0 ml、雙蒸水2.5 ml即可。

1.3 石蠟切片制作

1.3.1 組織固定

分別取人工感染試驗中發病羅非魚和對照組存活的健康羅非魚的鰓、肝臟、心臟、腹神經節等組織器官，按照龔志錦的方法Bouin's固定液固定24 h以上，保存。

1.3.2 水洗及脫水

倒掉固定液后用微流水洗滌過夜。依次經30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%及 100%酒精兩次脫水處理，每級脫水時間30 min。

然后經過透明、透蠟和包埋處理，最后進行切片與烘片。常溫下切片，切片厚度10 μm。每個組織塊切20片，蛋白膠固定。展片臺上展片后放入37℃烘箱中烘72 h。

1.4 染色及封片

在58℃烘箱中經二甲苯20 min兩次脫蠟后放入 1：1二甲苯與純酒精 5～10 min后依次放入100%、95%、90%、80%、70%、50%、30%的酒精中進行處理，每級5～10 min，然后放入純水中處理5～10 min。

經蘇木精染色，切片脫水及伊紅復染，最后進行切片透明及中性樹膠封片，并采用OLYMPUS顯微鏡觀察和拍片。

1.5 超薄切片制作

取羅非魚肝臟進行組織超薄切片的制作。超薄切片按照常規方法進行制作，即組織塊經戊二醛—鋨酸雙固定，梯度酒精脫水，環氧樹脂Epon 812包埋，Leica超薄機超薄切片，醋酸雙氧鈾—檸檬酸鉛雙染色法染色后，使用日立H－6000型透射電鏡觀察并且拍照。

2 結果

2.1 感染癥狀

羅非魚腹腔注射嗜水氣單胞菌后，主要癥狀為攝食量下降，活動能力減弱。48 h后腹部出現增大，腹腔注射部位紅腫，口部、各鰭基部、鰓蓋及鰓裂后部均有出血癥狀，眼球外突。部分羅非魚鰓蓋凹陷，鰓絲發白，肛門紅腫呈瀕死狀態。解剖后觀察可見肝胰臟呈土黃色，心、脾顏色暗紅，腸道少或無食物。各種癥狀表明，嗜水氣單胞菌對羅非魚肝、腎、脾、心、腸、鰓都造成不同程度的破壞，特別是對肝、腎和鰓的破壞程度較大。

2.2 肝細胞超顯微病理（見圖1）

電鏡照片主要觀察了肝細胞的重要器官線粒體的形態變化。與陰性對照組相比，超薄切片OS組的肝細胞內可見部分線粒體的內嵴折疊、變形甚至斷裂，失去正常的船梁結構，同時可見髓樣小體腫脹，部分腫脹破裂（見圖1－A）。而陽性對照則病變更加嚴重，某些組織壞死成一片無結構的區域（見圖1－C），而圖1－B為正常的線粒體，圖1－D為嗜水氣單胞菌的電鏡照片。

2.3 肝臟及鰓顯微病理（見圖2）

2.3.1 肝臟

正常羅非魚肝臟由無數肝小管組成。大體分為兩瓣，呈三葉狀，每一葉由許多小的分支的盲管組成，這些盲管通到每一葉的收集管，這三葉的收集管通過肝臟的主導管與中腸聯系。每一肝小管都是由位于基膜上的單層柱狀上皮細胞構成，細胞間界線清晰（見圖2-A）。OS組的羅非魚，其肝細胞部分水腫、變性，細胞排列可見輕度紊亂，部分細胞核壞死消失；隨后肝小管上皮細胞間界線消失，細胞壞死，見壞死物脫落入肝小管管腔(見圖2-B)；陽性對照組的羅非魚肝細胞病變更加嚴重，可見肝小管上皮增生，核大小不一，有的細胞水腫變性，細胞核固縮、碎裂或崩解（見圖2-C）。

圖1 肝細胞超顯微病理

圖2 肝臟及鰓顯微病理

2.3.2 鰓

正常羅非魚每條鰓由一扁平的鰓軸及其向兩邊發出的許多鰓葉組成。鰓葉最外面是角質層，向內是上皮細胞層，中間是鰓腔。上皮細胞向鰓腔突起形成隔，將鰓腔分成許多小通道，其內常有大而胞質著色淺的細胞，通道內有游離的血細胞（見圖2-D）。OS組的羅非魚的鰓也發生病變，并且在不同患病個體中，隨病情的嚴重程度不同其組織病理學變化也有所不同，鰓組織中出現細胞濁腫，鰓肌開始變性（見圖2-E）。而陽性對照組的羅非魚鰓葉上皮細胞及柱細胞廣泛變性，大部分區域出現細胞壞死，鰓葉腔擴張（見圖2-F）。

3 小結

過去10年，水產養殖在全球范圍內以高于30%的速度迅猛發展，進而成為農業領域增長最快的部分之一，但魚蝦疾病的頻發態勢嚴重制約了水產養殖的快速發展。鑒此，疫苗開發、水質調控以及飼料添加劑和藥物（如抗生素）等都以極快的速度應用于水產養殖領域，成為預防和控制水產動物疾病發生的有效手段。抗生素類產品已經在人類和畜禽動物的疾病預防與控制中得到廣泛的使用，而抗生素類產品在水產養殖過程中的應用卻出現了一些問題，這主要是與水產動物的給藥方式有關。水產養殖往往采用高密度、集約化養殖模式，考慮到養殖對象的特殊性，無論預防還是治療水產動物群體，實行個體給藥都是不可行的，群體藥飼和藥浴成為僅有的兩種備選給藥方案，但這兩種給藥方法都可能造成抗生素給藥濃度的不穩定性。這種不穩定的給藥濃度變化可使魚類長時間接觸到低于治療劑量的抗生素藥物濃度，長時間持續這種狀態可能導致水體和水產動物體內的病原菌產生針對某些抗生素耐藥菌株。耐藥菌株的存在可能對養殖者和水產養殖動物造成嚴重的不良后果。

植物提取物飼料添加劑由一系列的植物生物活性成分及其衍生物構成，長期以來就被當作香料、防腐劑和藥材使用。精油提取物是植物源提取物的核心成分，是一類芳香、揮發性化合物的混合物，植物原料常據其芳香特征來加以區分。精油是疏水性的化合物，包括醇、醛、酯、醚、酮、酚、萜等化學成分。精油分子結構中的六碳環會在植物的生長及動物攝食的過程中生成不同的生化組分，從而產生不同的生化功能。植物提取物類飼料添加劑被認定為“安全、高效、穩定、可控”的飼料添加劑，逐漸成為綠色環保安全動物食品生產和飼料工業充滿活力的新的經濟增長點。

對哺乳動物的研究發現，動物胃腸道對大量的刺激都反應敏銳，這些應激可能導致腸黏膜細胞的破壞，其屏障功能受損，從而進一步影響食物的消化吸收機能。酚的抗菌效果主要是對目標細菌細胞壁結構的影響，酚類物質作用于細胞壁，改變其對H+和K+的離子通透性。研究發現，精油會抑制革蘭氏陰性菌的代謝產物的活性，因為其分子很小，能夠通過外膜蛋白孔，進入質膜。萜類化合物和苯基丙烯類化合物的親脂性使其能穿過細菌的細胞膜達到細胞內部。精油還可促進消化酶的活性提高，促進脂質代謝和脂肪的消化吸收。關于植物精油的作用機制目前有幾種不同的理論，比如直接減少腸道菌群、刺激乳酸菌的產生、增強體液免疫和細胞免疫機能。不論對陸生動物還是水生動物，保持其消化道健康至關重要。眾多研究已證明硬骨魚類消化道相關淋巴組織（GALT）的存在。GALT是由淋巴細胞、漿細胞、粒細胞、巨噬細胞等組成的復雜系統。可以推測，植物源添加劑和魚類免疫功能的正常發揮有較好的協同作用，但這一作用的確切機制還需要進一步的科學研究。

本試驗研究發現，經嗜水氣單胞菌感染后，羅非魚的鰓和肝臟等實質器官都發生了較嚴重的病變。但經過3周投喂含止痢草提取物，試驗組羅非魚的鰓和肝臟病變情況有明顯緩解。如果持續數周添加，則可能恢復到正常。

17篇，刊略，需者可函索）