體外法研究瘤胃篩選真菌對嶗山奶山羊瘤胃發(fā)酵的影響

厲學(xué)武 王利華 孫艷朋 呂 娟 劉偉娟

纖維素是地球上最為豐富的有機(jī)物質(zhì)，如果能夠?qū)ζ溥M(jìn)行循環(huán)利用將對工農(nóng)業(yè)產(chǎn)生巨大的積極作用。我國秸稈年產(chǎn)量高達(dá)7億噸左右，其中玉米秸稈占有很大比重，是豐富的農(nóng)業(yè)資源，但由于其木質(zhì)纖維素含量高，生物降解緩慢，目前對其利用率不高。近年來對纖維素降解方面的研究已有不少報道，而最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法就是生物降解，因此越來越受到研究人員的關(guān)注。然而，纖維素降解高效菌種的缺乏仍然是目前利用生物降解木質(zhì)纖維素的主要障礙因子之一。

厭氧真菌產(chǎn)生一系列降解植物細(xì)胞壁的酶，這些酶以協(xié)同有序的方式共同作用于植物細(xì)胞壁。同時，厭氧真菌的發(fā)酵過程還產(chǎn)生大量生物活性物質(zhì)、有機(jī)酸和營養(yǎng)物質(zhì)。因此，如果通過高效菌株的篩選，將其培養(yǎng)液通過濃縮處理，把這套天然復(fù)合酶體系添加到飼料中，效果很可能比常規(guī)的單一酶制劑和人工復(fù)合酶制劑更好。楊紅建等（2010）研究了阿魏酸酯酶對羊草、玉米秸、稻秸及麥秸瘤胃體外發(fā)酵特性的影響。試驗表明，在粗飼料中添加2%比例阿魏酸酯酶39℃預(yù)處理16 h后，瘤胃微生物發(fā)酵VFA的產(chǎn)生量增加3%～13.9%。亦可顯著提高纖維性飼料的體外發(fā)酵產(chǎn)氣量。

1 材料與方法

1.1 真菌來源

通過瘤胃真菌發(fā)酵篩選高酶活的木聚糖酶和羧甲基纖維素酶得到4株瘤胃真菌A、B、C和D。

1.2 試驗動物、日糧及其飼養(yǎng)管理

本試驗選取2只體格健壯、體重相當(dāng)、裝有永久性瘤胃瘺管的嶗山奶山羊。每天飼喂兩次（8:00和20:00），日糧組成中粗飼料：混合精料=7：3。試驗羊于試驗前驅(qū)蟲，自由飲水，自由光照。

1.3 體外培養(yǎng)試驗

1.3.1 體外培養(yǎng)設(shè)計

根據(jù)日糧中按玉米秸稈添加2%的4種篩選真菌，設(shè)置對照組和4種試驗組，每組3個重復(fù)，分別排列于培養(yǎng)框架的前位與后位，以消除試驗誤差。培養(yǎng)底物玉米秸稈0.2 g，培養(yǎng)時間為24 h。

1.3.2 培養(yǎng)步驟

準(zhǔn)確稱取0.2 g秸稈飼料樣品置于玻璃注射器的前端（體外發(fā)酵瓶），取30 ml始終用CO2氣體飽和的人工瘤胃液加到每一個注射器中，按飼料的2%添加瘤胃真菌，用微量移液器將10 μl酶液添加至加酶組發(fā)酵瓶中,向瓶內(nèi)持續(xù)通入CO2氣體5 s,排凈注射器中的空氣，保持真空狀態(tài)，并封閉注射器，然后在39℃的水浴鍋中培養(yǎng)24 h。

1.3.3 瘤胃液的采集和人工瘤胃培養(yǎng)液的配置

晨飼（06:00）后2 h由2只嶗山奶山羊瘤胃內(nèi)上下左右不同位點采集足量瘤胃液，灌入經(jīng)預(yù)熱達(dá)39℃并通有CO2的保溫瓶中，灌滿后立即蓋嚴(yán)瓶口，迅速返回試驗室，經(jīng)40目的尼龍布過濾后持續(xù)通入CO2氣體5 min。將250 ml預(yù)先配制好并在39℃水浴中預(yù)熱的培養(yǎng)液與1000 ml在39℃水浴中預(yù)熱的蒸餾水混合之后再加入312.5 ml過濾后持續(xù)通入CO2氣體的瘤胃液，混合，攪拌均勻置于39℃恒溫水浴鍋中保存，人工瘤胃液始終通CO2氣體呈飽和狀態(tài)，待用。

1.4 樣品處理與分析方法

1.4.1 樣品預(yù)處理

體外培養(yǎng)24 h后，將注射器取出，迅速放入冷水浴中終止發(fā)酵，并將注射器中發(fā)酵液排出至離心管中，然后將瘤胃液離心（4000 r/min離心15 min），上清液制樣以備測定各個發(fā)酵指標(biāo)。

1.4.2 NH3－N 的測定

參照馮宗慈等（1993）的比色法測定。

1.4.3 產(chǎn)氣量（GP）

用注射器抽取30 ml制備好的人工瘤胃液（注射器提前裝好0.2 g飼料樣品），將注射器中的空氣排凈后封閉注射器，記錄活塞的初始位置刻度，然后在39℃的水浴鍋中培養(yǎng)24 h，讀取24 h內(nèi)各個不同時間點的產(chǎn)氣量。

1.4.4 微生物蛋白產(chǎn)量（MCP）

微生物蛋白分離采用差速離心法。參照Cotta等（1982）和 Broderick等（1989）闡述的方法。

1.4.5 瘤胃液VFA濃度

按照曹慶云（2006）的氣相色譜法進(jìn)行瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸的測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行整理，然后用Spss17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)在0.05、0.01水平上進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，試驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種瘤胃真菌篩選菌株對瘤胃液氨態(tài)氮（NH3－N）濃度的影響

表1 4種瘤胃篩選真菌對瘤胃液NH3－N的影響（mg/100 ml）

從表1可知，瘤胃篩選真菌D對瘤胃液NH3－N濃度的平均值比對照組顯著提高（P＜0.05）。在培養(yǎng)的2、4和8 h時，篩選的4種真菌與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；從8 h后4種真菌的差異性顯著程度逐漸縮小呈現(xiàn)不明顯性；在24 h發(fā)酵結(jié)束后，4種篩選真菌對培養(yǎng)液NH3－N濃度與對照組差異性不顯著(P＞0.05)。

2.2 4種瘤胃真菌篩選菌對瘤胃液產(chǎn)氣量（GP）的影響(見表2)

表2 4種瘤胃真菌篩選菌株對瘤胃液產(chǎn)氣量的影響(ml)

由表2可知，4種體外培養(yǎng)液中產(chǎn)氣量的變化趨勢一致，均隨時間呈現(xiàn)不斷增大的變化規(guī)律。在4 h時和8 h時，4種真菌與對照組相比差異不顯著；在18 h時，只有真菌A與對照組差異顯著（P＜0.05）；在12 h和24 h時，4種真菌都與對照組差異顯著（P＜0.05）；在24h發(fā)酵結(jié)束時4種真菌的產(chǎn)氣量與對照組相比分別提高了31.4%、25.5%、25.5%和31.5%。

2.3 24 h后，4種瘤胃真菌篩選菌對瘤胃液菌體蛋白（MCP）的影響(見表 3)

表3 4種瘤胃真菌篩選菌株對瘤胃液菌體蛋白的影響(g)

從表3可知，在24 h體外培養(yǎng)結(jié)束后，真菌B和D與對照組的差異性顯著（P＜0.05）；真菌A和C與對照組的差異性不顯著（P＞0.05）。

2.4 4種瘤胃真菌篩選菌在24 h時對瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度的影響(見表4)

表4 4種瘤胃真菌篩選菌株對VFA濃度的影響(mmol/100 ml)

從表4可知，在24 h時，與對照組相比，日糧添加各種真菌的各組培養(yǎng)液中的VFA含量均差異顯著（P＜0.05）。4種真菌的乙酸濃度與對照組相比差異顯著（P＜0.05），真菌D與真菌A、B和C差異也顯著（P＜0.05）；4種真菌的丙酸濃度與對照組相比差異顯著（P＜0.05），而真菌A、B和D與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）；真菌C的丁酸濃度與對照組相比差異顯著（P＜0.05），真菌A、B和D與對照相比差異極顯著（P＜0.01）；在總VFA方面，真菌D的TVFA含量最高，達(dá)到了53.97 mmol/100 ml，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），而其乙酸/丙酸為最低，并與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

反芻動物瘤胃的發(fā)酵功能受多種因素(如日糧組成、動物本身的生理狀況)的影響，其優(yōu)劣表現(xiàn)在各個發(fā)酵指標(biāo)上，包括pH值、VFA含量、MCP含量、產(chǎn)氣量和NH3－N濃度等。Lee等（2000)報道，給綿羊瘤胃每天灌注200 ml厭氧真菌培養(yǎng)物(包括厭氧真菌酶和厭氧真菌細(xì)胞)后，綿羊?qū)I養(yǎng)物質(zhì)的利用率提高，對氮在瘤胃中的保護(hù)作用亦提高。

在整個試驗培養(yǎng)過程中，各添加組的瘤胃氨氮濃度變化范圍為11.96～19.65 mg/100 ml，處于已報道的最佳 NH3－N 濃度（6.3～27.5 mg/100ml）范圍之內(nèi)。楊紅建等（2010年）研究了阿魏酸酯酶處理對羊草、玉米秸、稻秸及麥秸瘤胃體外發(fā)酵特性的影響。試驗表明，2%阿魏酸酯酶添加預(yù)處理亦可顯著提高羊草和麥秸的體外發(fā)酵產(chǎn)氣量（+42.2%和+16.6%），麥秸體外發(fā)酵產(chǎn)氣速率提高37.5%。楊亮宇（2002）用瘤胃持續(xù)模擬技術(shù)研究玉米和稻草在瘤胃內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）量、VFA 能。結(jié)果表明：添加 A、B、C、D、E和F的6種真菌培養(yǎng)物發(fā)酵的玉米和稻草0～72 h的TVFA 每 100 ml 中 分別 為 5.07、4.31、8.77、4.30、9.75、3.33 mmol和 4.09、23.36、8.68、7.66、9.95 和 2.94 mmol，發(fā)現(xiàn)以E菌處理的產(chǎn)酸量和VFA能最高。試驗中，添加篩選瘤胃真菌的丙酸濃度極顯著提高、乙酸/丙酸的比例均呈現(xiàn)下降趨勢，使瘤胃發(fā)酵中丙酸發(fā)酵比例增加，改變了發(fā)酵模式，提高反芻動物對發(fā)酵終產(chǎn)物的利用率。在培養(yǎng)液中按培養(yǎng)底物秸稈添加2%的篩選真菌A、B、C和D可顯著提高培養(yǎng)液中的菌體蛋白和VFA含量，產(chǎn)氣量和NH3－N含量相對于對照組也有一定程度的提高。說明添加篩選瘤胃真菌可為反芻動物生長發(fā)育提供更充分的能量，促進(jìn)其生長。縱觀4種篩選真菌對瘤胃總體發(fā)酵功能的影響，可以發(fā)現(xiàn)真菌D對改善瘤胃發(fā)酵功能的綜合作用效果最為理想。

4 小結(jié)

在體外條件下，添加瘤胃篩選真菌能改善瘤胃的發(fā)酵特性，而且這種改善狀況受真菌種類影響。從本試驗的結(jié)果來看，4種篩選真菌對瘤胃發(fā)酵都有一定的影響。整體來看，篩選真菌D對提高嶗山奶山羊的瘤胃發(fā)酵功能效果最好，真菌D工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)工藝正在研究之中，可繼續(xù)研究在飼用酶濃縮劑或酶制劑生產(chǎn)中有所應(yīng)用。

10篇，刊略，需者可函索）