新疆棉花秸稈中乳酸菌的分離與鑒定

張永輝 嚴 萍 阿布都克尤木·麥麥提 麥熱姆妮薩·艾麥爾 樊 振 烏斯滿·依米提

新疆是中國產棉大區，多年來棉花種植面積占到全國的1/3，種植面積達2000多萬畝，棉花總產量200多萬噸。棉稈年均產量為540萬噸。棉稈除一部分用于還田外，大多數被用作柴禾。開發利用棉稈資源,是提高棉田經濟效益的有效途徑之一。

許國英等(1998)[1]對棉花秸稈營養成分進行了測得,棉稈中的粗蛋白含量為9.96%，優于稻草、麥秸；粗纖維含量為32.15%；木質素含量為36.2%，比其它主要農作物含量高2.5～3倍。但由于在自然狀態下的棉稈粗蛋白含量低而粗纖維含量高，因此消化率低、適口性差，農戶普遍很少喂養家畜。只有通過青貯、氨化等方法處理，才能解決這一問題[2]。而添加乳酸菌青貯是目前研究的熱點，牧草上天然附著的乳酸菌在青貯發酵過程中起著非常重要的作用。本研究以新疆吐魯番地區棉花秸稈為實驗對象，采用傳統生理生化和16S rRNA相結合的方法，分離出4珠乳酸菌，并從中篩選出優良乳酸菌，為進一步以棉花秸稈為原料制作青貯飼料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

2009年10月采集新疆吐魯番地區棉花秸稈樣品。

1.1.2 培養基與試劑

MRS+CaCO3瓊脂培養基、MRS液體培養基、糖類發酵基礎培養基等，參照楊潔彬(1991)、凌代文(1999)、東秀珠(2001)的方法配制。

1.1.3 設備

GMSX-280型手提式壓力蒸氣消毒器：北京市永光明醫療儀器廠生產；ISO900型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司生產；超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司生產；GXZ型智能光照培養箱：寧波江南儀器廠制造；PHS-501精密酸度計：上海鵬順科學儀器有限公司生產；Perkin Elmer CeneAmp 9600 PCR儀：北京北加美因生物技術有限公司生產；DYCP-31C型瓊脂糖電泳儀：北京市六一儀器廠生產。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

取棉花秸稈30 g，裝入盛有220 ml 0.9%滅菌生理鹽水的三角瓶內，充分攪拌，將此溶液稀釋到10-2～10-7倍，取 10-4、10-5、10-6和 10-74 個稀釋度，將稀釋后的懸液涂布在MRS+CaCO3平板上，培養條件為30℃，72 h。根據菌落的顏色、大小、光澤、是否有透明圈，挑取單菌落，多次劃線分離純化后，進行革蘭氏染色、鏡檢觀察菌體大小、形狀及排列方式。將純菌接種到MRS液體培養基中，培養48 h后（懸液：30%液體石蠟=1：1）4℃的冰箱保存備用。

1.2.2 乳酸菌屬種的鑒定

凡是革蘭氏染色陽性、過氧化酶陰性的菌株初步定為乳酸菌[5]，乳酸菌的生理生化試驗參照相關楊潔彬(1991)、凌代文(1999)、東秀珠(2001)方法，確定屬。

1.2.3 16S rRNA基因序列同源性分析

將分離的乳酸菌菌株，采用CTAB法提取基因組DNA[6-7]，采用正向引物27f:5-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3，反向引物1492R:5-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，進行PCR擴增[8]，擴增條件：PCR反應條件為:95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環，72℃延伸10 min。產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段長度正確的PCR產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。測序結果通過http://www.ncbi.nih.nlm.gov網站用BLAST進行序列同源性比對，然后在GenBank注冊序列號。用MEGA4.0的Neighbor-Joining[9]法構建系統發育樹，并進行1000次Bootstraps檢驗。

1.2.4 乳酸菌產酸試驗

將分離并鑒定的4株乳酸菌分別按5%的接種量接入MRS液體培養基中，37℃恒溫培養。每隔2 h測定不同菌株發酵液pH值并繪制產酸速率曲線。

2 結果與分析

2.1 菌落特征及個體形狀

初步分離出菌株13株。經革蘭氏染色鏡檢、過氧化氫酶反應得到革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性符合乳酸菌特征的菌株 4 株, 編號為 Z1、Z2、Z4、Z5，進一步在MRS平板上觀察菌落形態，結果見表1。

表1 乳酸菌的形態特征

經過菌體菌落形態觀察、革蘭氏染色、過氧化氫酶等試驗，表明有4株菌為乳酸菌，其中菌株Z1、Z2革蘭氏陽性，圓球形，對生，菌落為乳白色，扁平，表面光滑，菌落周圍具有透明圈。Z4、Z5革蘭氏陽性，短桿狀，單個或呈鏈狀排列，菌落為乳白色，中央凸起，表面光滑，菌落周圍具有透明圈。

2.2 乳酸菌鑒定結果

對分離得到的純菌株進行部分生理生化試驗鑒定，結果見表2。

將分離的4株乳酸菌進行部分生理生化實驗，結果表明：均為革蘭氏染色陽性，不運動，在H2O2酶實驗、H2S實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗、硝酸鹽還原實驗、葡萄糖產氣實驗呈陰性。其中Z1、Z2在15℃、45℃，pH值4.5，6.5%NaCl生長良好，不發酵乳糖和蔗糖。結合形態特征，初步定為片球菌屬。Z4、Z5在15℃，pH值4.5生長，在45℃，6.5%NaCl不生長。結合形態特征，初步定為乳桿菌屬。

2.3 序列分析和系統發育樹的構建

表2 乳酸菌屬的鑒定結果

16S rRNA基因序列分析顯示，菌株Z1(HQ589248)的16S rRNA基因序列長度為1407 bp核苷酸，菌株Z2(HQ589249)的16S rRNA基因序列長度為1377 bp核苷酸，菌株Z4(HQ589250)的16S rRNA基因序列長度為1372 bp核苷酸，菌株Z5(HQ589251)的16S rRNA基因序列長度為1390 bp核苷酸。與從GenBank中相關乳酸菌菌種的16S rRNA基因序列進行比較，并用MEGA4.0的Neighbor－Joining法構建系統發育樹。結果見圖1。菌株Z1(HQ589248)、Z2(HQ589249)與 Pediococcus pentosaceus(AJ305321)的相似性為99%。菌株 Z4(HQ589250)、Z5(HQ589251)與 Lactobacillus plantarum subsp.plantarum(ACGZ01000098)的相似性為100%。一般來講，在種分類等級上，如果2個分類單位間的16S rRNA序列同源性大于97.5%，則認為屬于同一個種[10－11]。因此，將 Z1(HQ589248)、Z2(HQ589249)鑒定為戊糖片球菌，將Z4(HQ589250)、Z5(HQ589251)鑒定為植物乳桿菌。

圖1 分離乳酸菌菌株16S rRNA基因序列建立的系統發育樹

2.4 產酸速率測定結果(見圖2)

圖2 37℃發酵過程中pH值的變化

由圖2可以看出，4株菌接種2～6 h內菌株發酵液的pH值迅速下降，6～14 h pH值下降緩慢，并且都有較強的產酸能力，6 h后pH值都能達到4.0以下，其中戊糖片球菌中Z2的產酸能力較強，14 h pH值就能達到3.5；植物乳桿菌中Z5的產酸能力較強，14 h pH值就能達到3.48。在青貯飼料的制備過程中pH值的快速降低能夠顯著抑制青貯原料中的有害微生物，如酵母、霉菌等，從而提高青貯飼料的品質。因此菌株Z2和Z5可被用作以棉花秸稈為原料的青貯飼料添加劑。

3 結論

3.1 從新疆吐魯番地區棉花秸稈中分離得到Z1(HQ589248)、Z2(HQ589249)、Z4(HQ589250)、Z5(HQ589251)4株菌，根據形態特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析，參閱《伯杰士細菌學手冊》(第九版)及《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》鑒定為Z1(HQ589248)、Z2(HQ589249)為戊糖片球菌，Z4(HQ589250)、Z5(HQ589251)為植物乳桿菌。

3.2 對已鑒定的乳酸菌進行產酸速率試驗，4株菌都有較強的產酸能力，戊糖片球菌中Z2菌株的產酸能力較強，14 h pH值就能達到3.5。植物乳桿菌中Z5菌株的產酸能力較強，14 h pH值就能達到3.48?？捎米饕悦藁ń斩挒樵系那噘A飼料添加劑。

3.3 青貯是在厭氧條件下，通過附生于植物體的乳酸菌利用原料中的可溶性碳水化合物，厭氧發酵產生有機酸(主要是乳酸)，導致pH值降低，從而殺滅各種微生物或抑制其繁衍，達到保存青綠飼料的目的(Mc－Donald等，1991)。然而由于自然界牧草上存在的乳酸菌含量少，僅占細菌總數的0.01%～1%,所以在發酵過程中乳酸菌很難迅速的形成優勢菌群，不能在短時間內降低pH值，青貯的效果得不到明顯的改善。因此，正確選擇青貯添加劑在很大程度上對畜牧業的發展起到促進作用。接種劑中的乳酸菌通常是從作物或青貯料中篩選出來的，之所以被選擇是因為其繁殖迅速，并且是同型發酵。由于它們是自然界中的同型發酵菌，一般認為它們將對青貯質量產生積極的影響。實驗從新疆吐魯番地區棉花秸稈中分離的4株乳酸菌，來源于棉花秸稈，更容易適應青貯發酵環境。本實驗室將進一步以這兩株菌作為添加劑來制備以棉花秸稈為原料的青貯飼料，研究這兩株菌對棉花秸稈青貯發酵品質的影響，為充分利用新疆棉花秸稈、發展畜牧業提供理論依據。

[1]許國英,熱合木都拉,馬英杰.棉花秸稈的飼用價值研究[J].新疆畜牧業,1998(3):10-11.

[2]吳杰.新疆棉花秸稈利用現狀分析和探討[J].中國棉花,2006,33(2):9-11.

[3]楊潔彬,郭興華,凌代文.乳酸菌生物學基礎及應用[M].北京:中國輕工業出版社，1991:1-3.

[4]凌代文.乳酸菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業出版社,1999:1-25.

[5]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001.

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