谷胱甘肽拮抗錳致雄性大鼠生殖損傷的研究

王乾興 金 華 張先平

1.貴州省遵義醫學院細胞生物學與遺傳學教研室(563003);2.貴州省習水縣人民醫院急診科;3.貴州省遵義醫學院組織胚胎學教研室

過量錳可導致人和動物睪丸生長發育與成熟的延遲、精液濃度和活性精子率降低，最終引起生精功能障礙等一系列生殖毒性［1～4］。本研究小組前期發現過量錳誘導的生精細胞凋亡與細胞內氧化應激有關［5］。谷胱甘肽(GSH)是細胞內重要的抗氧化劑，在抗氧化損傷中具有重要作用。為此，本實驗采用錳對SD大鼠進行急性和亞急性染毒，然后投放GSH以觀察其對錳染毒誘發的生精細胞凋亡及睪丸脂質過氧化產物——丙二醛(MDA)、抗氧化酶——谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)的影響，以探討GSH對錳致雄性大鼠生殖損害的拮抗機理，為錳中毒的預防和治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

由第三軍醫大學動物中心提供的清潔級健康雄性SD大鼠48只［合格證號:SCXK(渝)20020003］，體重150～180g，隨機平均分為對照組、染錳組和GSH拮抗組。

1.2 主要試劑

MnCl2·4H2O(分析純)購于中國醫藥集團上海化學試劑公司;GSH(分析純)購于美國Sigma公司;TUNEL試劑盒購于德國Boechringer Mannheim公司;MDA和GSH－Px檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 模型建立與標本制備

染錳組和GSH拮抗組大鼠各分成兩批，30mg/kg MnCl2·4H2O染錳1周(急性染毒)和4周(亞急性染毒)，再分別給予生理鹽水(染錳組)和1mmol/kg GSH(GSH拮抗組)2周［6］，對照組給予生理鹽水。以上各組動物的給藥途徑均為腹腔注射，1次/d，每周5d。停藥后繼續觀察2周，分批處死動物，每組各8只，取雙側睪丸分別進行冷凍切片和制備組織勻漿。

1.4 TUNEL法檢測生精細胞凋亡

冷凍切片置于4%多聚甲醛固定30min，PBS沖洗后入0.3%H2O2－甲醇溶液中封閉10min，PBS沖洗后，0.1%Triton X－100－0.1%枸櫞酸鈉溶液中冰浴2min，PBS沖洗后加TUNEL反應混合液，37℃孵育1h，PBS沖洗后加轉化劑POD(37℃)反應30min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。同時設陰性對照和陽性對照(用10μg/ml DNAase I預處理切片)。以上各步均PBS沖洗5min×3次。

1.5 化學比色法檢測睪丸MDA和GSH－Px活性

準確稱取少量睪丸組織，加入生理鹽水，超聲粉碎制備1%組織勻漿，3 000rpm離心10min，用考馬斯亮藍法測定上清液組織蛋白濃度，按試劑盒說明書測定MDA和GSH－Px活性。

1.6 統計學分析

每張切片隨機選擇10個精細小管，計算生精細胞凋亡指數(AI)，即凋亡陽性生精細胞數/總生精細胞數。所有計數資料以±s表示，采用SPSS 17.0軟件進行方差分析。

2 結果

2.1 GSH對急性與亞急性錳染毒大鼠生精細胞凋亡的影響

各組大鼠均可見以精原細胞和精母細胞為主的凋亡生精細胞(圖1)，其細胞核呈棕褐色。急性錳染毒時，染錳組生精細胞AI明顯高于對照組(P＜0.01)，GSH拮抗組生精細胞AI明顯低于染錳組(P＜0.01)，且與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。亞急性錳染毒(4周)時，染錳組生精細胞AI明顯高于對照組(P＜0.01)，GSH拮抗組生精細胞AI明顯低于染錳組(P＜0.01)而高于對照組(P＜0.01)。見表1。

圖1 大鼠生精細胞凋亡(TUNEL×200)

2.2 大鼠睪丸MDA含量和GSH－Px活性測定結果

急性錳染毒時，染錳組睪丸MDA含量明顯高于對照組(P＜0.01)，GSH拮抗組睪丸MDA含量明顯低于染錳組(P＜0.01)，而與對照組無差異(P＞0.05);GSH－Px活性在各組間比較均無差異(P＞0.05)。亞急性錳染毒時，染錳組睪丸MDA含量明顯高于對照組(P＜0.01)，GSH拮抗組睪丸MDA含量明顯低于染錳組(P＜0.01)，但仍明顯高于對照組(P＜0.01);染錳組睪丸GSH－Px活性明顯低于對照組(P＜0.01)，GSH拮抗組睪丸GSH－Px活性明顯高于染錳組，而與對照組無統計學差異(P＞0.05)，見表1。

表1 GSH對不同時間錳染毒大鼠生精細胞AI及睪丸MDA含量和GSH－Px活性的影響(±s)

表1 GSH對不同時間錳染毒大鼠生精細胞AI及睪丸MDA含量和GSH－Px活性的影響(±s)

*與對照組比較P＜0.01 Δ與染錳組比較P＜0.01

對照組 0.39 ±0.09 0.50 ±0.11 33.56 ±3.49 0.48 ±0.010.60 ±0.12. 30.64 ±4.20染錳組 0.99 ±0.14* 1.15 ±0.22* 29.37 ±3.24 1.80 ±0.21* 2.44 ±0.49* 23.55 ±5.27*GSH 拮抗組 0.52±0.08Δ 0.64±0.15Δ 31.91±4.17 1.12±0.20*Δ 1.31±0.51*Δ 31.20±5.30Δ

3 討論

過量錳可通過血－睪屏障蓄積在睪丸內，損傷生精功能，抑制精子發生。本研究組前期工作證實，過量錳可引起睪丸組織自由基生成增多，導致生精細胞凋亡增加［5］。自由基是生物體產生并損害自身的毒性產物，可引起脂質過氧化反應，產生脂質過氧化物。MDA是脂質過氧化的終產物，其含量反映機體脂質過氧化的速率及強度，可間接反映組織細胞受自由基損傷的程度［6］。GSH－Px是生物體內重要的抗氧化酶，能有效清除自由基、對抗自由基損傷。本研究發現，急性錳染毒時生精細胞AI增加，睪丸組織MDA含量升高，表明急性染錳可引起睪丸組織的脂質過氧化，產生過量的MDA，使生精細胞受損、凋亡增加。而在亞急性錳染毒時生精細胞AI與睪丸組織MDA含量進一步升高，GSH－Px活性進一步下降，提示隨著染錳時間的延長，大鼠體內的脂質過氧化反應也在相應增強，MDA產量繼續增加，消耗了大量如GSH–Px等的抗氧化物質，使睪丸氧化與抗氧化系統失衡，引起生精細胞凋亡增加，最終導致精子質量下降，降低生育力。

GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的一種含巰基的天然三肽。其所含巰基是發揮作用的主要基團，在蛋白質和DNA合成、物質運輸、新陳代謝及細胞保護等生物學功能中起著重要作用。GSH還是許多酶的輔基，參與體內三羧酸循環及糖代謝，具有抗氧化、解毒、抗癌及消除疲勞等作用［7～9］。人體在衰老、感染、中毒、外源性毒素、氧化應激等狀態下，細胞內GSH生物合成能力降低、含量下降。因此，病理狀態下內源性GSH減少時，適時補充外源性GSH便成為必需，可以預防、減輕或終止組織細胞的損傷，改變病理生理過程。研究表明GSH對砷誘導的血管內皮細胞凋亡有保護作用［10］。本實驗結果發現，大鼠急性錳染毒后給予GSH，生精細胞AI與睪丸MDA均恢復至正常水平，提示GSH能減輕急性錳染毒引起的睪丸脂質過氧化損傷，對生精細胞起到有效的保護作用。其機制可能為:第一，通過巰基與體內的自由基結合，使其轉化成易代謝的酸類物質，從而加速自由基的排泄;第二，可以中和氧自由基，避免活性氧和氧自由基引起的脂質過氧化，從而避免細胞的損傷;第三，GSH含有的谷氨酰胺鍵，可維持細胞內分子的穩定性，減輕自由基對分子的損傷［11］。

本實驗還顯示，亞急性錳染毒后給予GSH，大鼠睪丸GSH－Px活性恢復至正常水平，MDA濃度和生精細胞AI雖然明顯下降，但并不能恢復至正常水平，提示GSH對錳染毒的拮抗作用是有一定限度的，可能隨著錳染毒時間的延長，大鼠抗氧化能力的持續消弱已經造成了睪丸組織的不可逆性損傷，GSH－Px活性的恢復可能是由于其底物GSH增加而造成的。也可能在生精細胞的抗氧化過程中，其它抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)在發揮著更重要的作用。綜上所述，過量錳可誘導生精細胞凋亡，造成生精功能障礙，及時補充GSH可預防或減輕錳染毒所致的生精障礙的發生。

1 Cheng J，Fu JL，Zhou ZC.The inhibitory effects of manganese on steroidogenesis in rat primary Leydig cells by disrupting steroidogenic acute regulatory(StAR)protein expression［J］.Toxicology，2003，187(2－3):139－148.

2 Sharpe RM.Hormones and testis development and the possible adverse effects of environmental chemicals［J］.Toxicol Lett，2001，120(1－3):221－232.

3 Wirth JJ，Rossano MG，Daly DC，et al.Ambient manganese exposure is negatively associated with human sperm motility and concentration［J］.Epidemiology，2007，18(2):270－273.

4 Ponnapakkam TP，Bailey KS，Graves KA，et al.Assessment of male reproductive system in the CD－1 mice following oral manganese exposure［J］.Reprod Toxicol，2003，17(5):547－551.

5 張先平，王乾興，才秀蓮，等.錳對大鼠睪丸抗氧化能力及生精細胞凋亡的影響研究［J］.中國計劃生育學雜志，2007，15(7):408－410.

6 Serra JA，Marschoff ER，Dominguez RO，et al.Comparison of the determination of superoxide dismutase and antioxidant capacity in neurological patients using two different procedures［J］.Clin Chim Acta，2000，301(1－2):87－102.

7 Franco R，Schoneveld O J，Pappa A，et al.The central role of glutathione in the pathophysiology of human diseases［J］.Arch Physiol Biochem，2007，113(4－5):234－258.

8 Wisnewski AV，Liu Q，Liu J，et al.Glutathione protects human airway proteins and epithelial cells from isocyanates［J］.Clin Exp Allergy，2005，35(3):352－357.

9 Wu G，Fang YZ，Yang S，et al.Glutathione metabolism and its implications for health［J］.J Nutr，2004，134(3):489－492.

10 孫鮮策，蔡竹，劉爽.GSH對砷氧化損傷保護作用的研究的內皮細胞凋亡的保護作用［J］.大連醫科大學學報，2008，30(6):500－503.

11 彭憲忠，趙磊，王淑英，等.還原型谷胱甘肽的應用時序對放射損傷的影響［J］.濱洲醫學院學報，2007，30(2):101－103.