FISH技術在診斷唐氏綜合征及植入前遺傳學診斷中的臨床應用

萬均輝 鐘澤艷 田佩玲 韋相才，* 張清健 李銘臻

1.南方醫科大學醫學遺傳教研室(廣州，510080);2.廣東省計劃生育科學技術研究所

唐氏綜合征又稱21－三體綜合征或先天愚型，是由于生殖細胞在減數分裂過程中染色體未分離所致。目前，對于此病尚無有效的治療手段。因此，在孕期及早、準確地做出診斷，防止患兒出生是降低患病率的重要措施。近年來，建立快速有效、簡便準確、易于推廣的唐氏綜合征產前診斷方法是研究的熱點之一［1］。傳統細胞遺傳學方法又稱染色體核型分析是目前公認的診斷染色體異常的金標準，但受細胞培養成功率與核型質量不甚穩定的影響，該技術的普及受到一定限制。本研究探討在染色體核型分析基礎上，建立優化熒光原位雜交技術(FISH)，用于產前唐氏綜合征診斷和單細胞植入前遺傳學診斷(PGD)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

外周抗凝靜脈血采集于廣州智靈學校;羊水標本由中山大學達安基因診斷中心提供。未受精卵、卵裂球來自本所生殖中心實驗室。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器有熒光顯微鏡。主要試劑采用荷蘭Kreatech混合探針，由廣東友寧貿易有限公司提供(雙色，X，21)。2l號和X染色體檢測探針為位點特異性探針，分別用紅色和綠色標記。其他試劑:①20×SSC:氯化鈉175g，檸檬酸三鈉88.2g，加三蒸水到1 000ml。②變性液:甲酰胺 28ml，20 × SSC 4ml，蒸餾水8ml，終體積40ml，充分混勻，調整pH至7.0～8.0，密封保存于4～8℃，每次使用前均需測定pH值。③洗脫液:甲酰胺20ml，20×SSC 4ml，蒸餾水16ml，終體積 40ml。④SSCT:20 × SSC 100ml，Tween－20 0.2ml，加雙蒸水至終體積為 1 000ml。

1.3 標本收集

1.3.1 外周靜脈血 外周血直接涂片，封片，備用;外周血淋巴細胞和羊水細胞培養及核型分析，按標準方法進行。

1.3.2 羊水 抽取羊水 5～6ml，1 500 rpm 離心10min，去上清，留羊水細胞沉淀，在細胞沉淀中加3ml 0.25%trypsin(溶于無 CaCl2的 Hanks液)，37℃消化30min;2 000rpm離心10min，去上清，在沉淀中加入 4 ～5ml 0.75mol/L KCl，37℃孵育 30min;加入1ml固定液(甲醇∶冰醋酸為3∶1)，輕輕混勻，2 000rpm離心10min，去上清;加5ml固定液，輕輕混勻，2 000rpm離心10min，去上清;加適量固定液，混勻靜置10min，滴片。滴好的玻片浸泡在37℃的2×SSC液30min，取出浸泡在37℃的0.005%胃蛋白酶15min，然后在室溫依次用70%、85%、100%的酒精脫水各2min，風干，加探針混合液，用封片膠封片，變性，雜交過夜。

1.4 標本處理

1.4.1 探針和標本共變性 在22mm×22mm區域內加入10μl探針，蓋上蓋玻片，放置于75℃熱臺上5～10min，變性。

1.4.2 雜交 放入37℃的濕盒內雜交4～20h。

1.4.3 洗脫 放入室溫1× Wash Buffer II(2×SSC/0.1%Igepal)中浸泡2min，揭開去除蓋玻片;在72℃的1 ×Post－Wash Buffer I(0.4 × SSC/0.3%Igepal)中浸泡2min;在室溫1×Wash－Buffer II(2×SSC/0.1%Igepal)洗液中浸泡 1min;在 70%，85% 和100% 甲醇中浸泡各1 min，室溫晾干;加入15μl復染液DAPI/Antifade，顯微鏡下觀察。

1.5 未受精卵、卵裂球的FISH

1.5.1 卵子的獲得 接受體外受精－胚胎移植(IVF－ET)技術治療的患者應用控制性超排卵方案后，在常規B超引導下用17G穿刺針經陰道取卵。

1.5.2 卵子、精子的培養 采用Vitorlife公司的系列IVF培養基。卵子在體外培養4～6h(IVF－20培養液)，在含80U Hyaluronidase液中去除卵丘復合體，將出現第一極體的成熟卵移入Gamete培養液中備用。直接洗滌精液，將分離的精子放置IVF－20培養液，37℃培養箱培養備用。

1.5.3 受精與觀察 采用常規或卵細胞漿內單精子注射術(ICSI)受精，次日觀察。選取未受精卵、卵裂球(2C)固定在載玻片上，按常規方法處理:加入1ml固定液(甲醇∶冰醋酸為3∶1)固定好的玻片浸泡在37℃的2×SSC液30min，取出，浸泡在37℃含0.005%胃蛋白酶液體內15min，然后在室溫下依次用70%、85%、100%酒精脫水各2min，風干，加探針混合液，用封片膠封片，變性，雜交過夜。

1.5.4 雜交、洗脫、顯色 如前所述。

2 結果

2.1 外周血和羊水FISH結果

應用21號和X染色體特異性熒光素標記雙色混合探針FISH技術檢測正常羊水間期細胞作為對照:21號染色體在鏡下顯示為兩個紅色點，X染色體顯示為兩個綠色點，確定核型為正常女性核型(46，XX)，如圖1所示。對25例唐氏綜合征患兒外周血以及10例血清篩查陽性孕婦羊水間期細胞進行FISH檢測:21號染色體在鏡下顯示為三個紅色點，X染色體顯示兩個綠色點，核型為21三體(47，XX，+21)，如圖2所示。該35例標本經核型分析確證，未出現假陰性和假陽性結果。

2.2 未受精卵、卵裂球FISH結果

應用21號和X染色體特異性熒光素標記雙色混合探針FISH技術進行單個未受精卵間期細胞的PGD，顯微鏡下觀察的FISH分析雜交信號明顯、清晰、肉眼可辨。21號染色體在鏡下顯示為兩個紅色點，X染色體顯示一個綠色點，確定為異常核型結構(24，X，+21)，結果如圖3所示。通過對單個卵裂球間期細胞進行PGD，21號染色體在鏡下顯示為兩個紅色點，X染色體顯示兩個綠色點，確定為正常核型結構(46，XX)，結果如圖4所示。

3 討論

對于染色體異常的診斷，傳統的細胞遺傳學方法往往采用細胞培養與染色體顯帶分析法。由于該方法是通過羊膜腔穿刺或絨毛膜取樣獲得胎兒來源細胞，經體外培養后對處于中期分裂象的染色體進行核型分析，結果獲取一般需要2周甚至更長時間，而孕婦長時間等待易導致心理上的焦慮和緊張，不利于胎兒的宮內發育［2］。20世紀90年代以后，隨著分子生物學技術的發展以及向各學科的滲透，出現了一種新的運用分子手段分析染色體異常的方法，即染色體FISH技術，該技術不僅可用于中期分裂象，還可在間期細胞顯示雜交信號，尤其適用于那些難以培養成功的各種組織細胞(羊水、絨毛、外周血等)，并且大大縮短了產前診斷的時間。FISH方法是將DNA探針用不同顏色熒光染料標記，與固定在玻片上的卵裂球細胞不同染色體雜交后，在熒光顯微鏡下被雜交的部分呈現不同顏色的熒光，從而對染色體異常進行篩查。目前在部分發達國家已將FISH診斷染色體數目異常作為了一項常規手段［3］，國內研究人員也進行了很多有益的嘗試［4］。

本研究在參考國內外多種方法的基礎上，利用熒光素標記的雙色混合探針直接對唐氏綜合征進行FISH分析，并建立了一套穩定的FISH方法。經過染色體核型確證，具有較高的符合率(100%)，與國外的符合率一致［5，6］。FISH與常規染色體顯帶分析法相比，有如下優點:用材少、快速(24h內可出結果)、不需體外培養、在極短時間內可檢測大量細胞;可對分散不好的分裂象做出明確診斷;能分析一部分顯帶染色體技術不易分辨的異常［7］，如復雜易位、倒位、微小缺失、復雜畸變等;敏感性和特異性高［8～11］。因此，FISH技術可應用于未經培養的分裂期和間期細胞中染色體異常的分析。而間期細胞獲得容易，細胞數量多而使分析的細胞數目也相應的增多，這是FISH技術最大的優勢。由于FISH探針試劑的價格昂貴，極大地限制了它在臨床上的應用。本研究中FISH檢測全部采用的Kreatech混合探針，價錢相對比較低廉，節約了成本。本研究所應用的雙色FISH檢測，均未出現假陽性和假陰性結果，與傳統的細胞染色體核型分析結果一致;技術方法上更簡單、經濟，達到了檢測染色體異常的目的。同時，本研究對FISH實驗成本進行了優化，在研究過程中嘗試調整雜交液用量，將雜交液的用量減少，使得同樣的試劑可以應用到更多的標本上，對雜交效果沒有顯示出影響。研究結果顯示優化的實驗方案提高了快速檢出效能并且明顯降低了成本，為下一步大規模應用于臨床打下基礎。

胚胎PGD是指在體外受精過程中，對具有遺傳風險患者的胚胎活檢卵裂胚胎細胞，進行植入前遺傳學分析，以選擇正常的胚胎移植回母體子宮，獲得正常胎兒的診斷方法，可有效地防止有遺傳疾病的患兒出生［3，12］。PGD 是隨著人類輔助生殖技術，即IVF－ET技術發展而開展起來的一種新技術，是產前診斷的延伸，是遺傳學診斷的又一更有應用前景的新技術。對高齡孕婦和高危婦女進行PGD可以有效地避免遺傳病患兒的出生，可對異常胚胎進行治療性流產，避免中期妊娠遺傳診斷及終止妊娠所致的危險及痛苦［13］。PGD可從胚胎著床前各個階段活檢取樣，縮短了產前診斷的時效性，同時也避免了選擇性流產和多次流產可能造成的危害以及與倫理道德觀念的沖突。

通過FISH技術采用多種探針可診斷男、女性別和性連鎖疾病，也可診斷染色體疾病，包括數目和結構的畸變［14，15］。所以 FISH 技術的應用擴大了PGD的診斷范圍，特別是間期單核細胞FISH技術的成功，以及多種多樣FISH探針的開發，把PGD擴展到了染色體病的診斷。如FISH技術在PGD中的應用解決了胚胎性別的鑒定，排除性連鎖疾病的發生。如對于X連鎖隱性遺傳病，通過FISH技術鑒定性別，防止后代相應遺傳病的發生。同時，通過選擇正常和平衡配子或胚胎，PGD可顯著降低染色體易位導致的反復自然流產率，這是其他產前診斷無法比擬的。本研究探討FISH方法，對未成熟卵、未受精卵進行FISH雜交，結果與染色體核型分析一致，獲得良好的結果。如采用單細胞快速制備中期染色體的方法，結合多種FISH技術，如多重雜交FISH技術、光譜核型分析、比較基因組雜交等，將大大地提高PGD檢測的準確性和有效性。因此，FISH技術對于產前診斷唐氏綜合征及PGD，具有重要的臨床應用價值，是一種有前景的遺傳病產前診斷方法。

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