補體C3在男性不育患者血漿蛋白中的差異分布

辛 玲 朱曉紅 韓麗媛 郭 穎 于和鳴 王慧萍，*

1.國家人口計生委科學技術研究所(北京，100081);2.北京協和醫學院研究生院

世界衛生組織預測，男性不育癥將成為21世紀危害人類健康最為嚴重的三大疾病之一。我國育齡夫婦不孕不育率攀升到10% ～15%，接近發達國家(15% ～20%)水平。其中，男性不育因素占不孕不育癥的40%，且影響男性生育力的危險因素仍在增加［1］。在男性不育的病因中以少精子癥、弱精子癥和無精子癥為主，而引發原因有多種，如內分泌因素、遺傳因素及免疫因素等。血液是人體中重要的體液，血漿蛋白成分很復雜，機體功能異常時，血漿蛋白則會發生一定的變化［2］。本文利用電泳分離技術及質譜鑒定技術，對144例男性不育患者血漿與10例正常捐精者血漿蛋白進行分離，分析鑒定了男性不育患者與正常捐精者的血漿差異蛋白，為深入了解男性不育的發病機理奠定基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象

10例正常捐精者血漿樣本，來源于國家人口計生委科學技術研究所精子庫捐獻者，年齡24～30歲，其所捐精液數量、密度、活動率和形態分析等均在世界衛生組織所列正常范圍之內［3］。144例男性不育患者血漿樣本，來源于國家人口計生委科學技術研究所門診，年齡25～32歲。均為婚后正常性生活未避孕2年以上不育者(經檢查女方生育能力正常)，無外傷及遺傳性疾病家族史，無性功能障礙病史，無泌尿、生殖、造血系統及內分泌疾病，排除曾患其他慢性疾病、隱睪癥、性功能低下，未曾進行放療或化療，精液初步檢查結果顯示為無精子癥或少精子癥。

1.2 實驗材料

丙烯酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)和碘乙酰胺(IAA)(Merk公司);甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸及考馬斯亮藍G－250染料(USB公司);過硫酸銨(AP)和α－氰－4－羥基肉桂酸(CHCA)(Sigma公司);溴酚藍(Amresco公司);四甲基乙二胺(Amersham公司);胰蛋白酶(Roche公司);乙腈(ACN)(Fisher公司);碳酸氫銨(Fluka公司);三氟乙酸(Tedia公司)。其他試劑均為國產分析純(北京化學試劑公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 血漿蛋白定量 將血液樣本于4℃，2 000g離心15min，分離出血漿后，用Bradford法測定血漿蛋白濃度，血漿分裝并貯存于－80℃冷凍備用。

1.3.2 血漿蛋白分離－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE) 將正常捐精者血漿及最初收集的2例男性不育患者血漿用6%的SDS聚丙烯酰胺凝膠進行一維電泳分離，上層濃縮膠濃度為4%。根據所測的蛋白濃度計算樣品上樣體積，上樣終體積為20μl，其中含4μl 5×上樣緩沖液，DTT終濃度為100mM，ddH2O補足至終體積，充分混勻后在沸水水浴中加熱變性5min。用微量上樣器將預染分子量標準品和蛋白樣品分別上樣，60V恒壓30min使樣品集于濃縮膠底端，后用150V恒壓至溴酚藍前沿距膠底部0.5cm時停止電泳。蛋白上樣量為80μg。凝膠結束后進行考馬斯亮藍G－250染色。

1.3.3 凝膠圖像掃描分析 利用凝膠成像分析系統JY04S－3C對SDS－PAGE膠圖采集、保存和分析。

1.3.4 蛋白鑒定 切取差異條帶成1mm×1mm的膠粒，在25mM NH4HCO3/50%ACN中脫色，100%ACN膠粒脫水，經過10mM DTT/25mM NH4HCO3，56℃恒溫水浴1h，和25mM IAA/25mM NH4HCO3室溫避光孵育45min，加入適量胰蛋白酶(12.5 ng/μl)，4℃放置1h后，37℃酶切過夜(12 ～16h)，取酶切產物1μl和1μl CHCA基質混合后進行基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI－TOF/TOFMS)鑒定(4800 MALDI－TOF/TOF質譜儀，AB公司)。

1.3.5 差異條帶驗證分析 將剩余142例男性不育患者血漿按照1.3.2進行高分子量蛋白分離。

2 實驗結果

2.1 不育患者與健康捐精者血漿蛋白SDS－PAGE

將2例不育患者與健康捐精者的血漿利用6%低濃度SDS－PAGE凝膠進行高分子量蛋白分離后，凝膠掃描結果見圖1。如圖所示，高分子量(Mr＞95 kD)血漿蛋白SDS－PAGE膠圖中，在分子量200 kD及120 kD處分別出現了差異蛋白條帶(條帶a和條帶b)。其中條帶a僅在圖1中的正常捐精者(圖1中的第3、4、5及8泳道)出現，條帶b在不育患者(圖1中的第1和2泳道)非常明顯。

圖1 2例不育患者與5例正常捐精者血漿蛋白SDS－PAGE電泳圖

2.2 質譜鑒定

兩條差異條帶經MALDI－TOF/TOF質譜鑒定后，利用MASCOT軟件在SWISS－PROT蛋白質數據庫中對質譜結果進行檢索，鑒定結果均為補體C3，質譜圖及檢索鑒定結果見圖2。根據數據庫蛋白理論分子量及SDS－PAGE所顯示的蛋白條帶，初步認為圖1中蛋白條帶a和b是補體C3的不同片段形式。

2.3 差異蛋白驗證

收集的另外142份不育患者血漿蛋白分離結果見圖3。結果顯示，患者血漿SDS－PAGE膠圖中出現差異條帶(同時出現 a和 b)的有 135例(93.75%)。

3 討論

男性不育的發病機制尚不十分清楚，隨著其發病率的增加，引起了廣大科研工作者的關注。在無精子癥、少精子癥及弱精子癥的研究中，大多采用分子生物學技術，以尋找其差異基因表達譜的改變。蛋白質作為三大生命大分子之一，參與體內的各種生命活動。隨著蛋白質組學的發展，疾病狀態下蛋白質的變化及差異成為研究熱點［4，5］。血液是人體的一種重要體液，也是臨床檢查最常用的標本，血液檢測以分泌性蛋白為主，血漿蛋白占重要地位。機體出現異常或發生病變時，常通過血漿蛋白的變化反映出來，因此血漿蛋白的變化也成為臨床診斷、干預治療及預后評估的基礎。為此，我們設計此實驗以找尋男性不育與正常人血液中的差異表達蛋白，以期深層探討不育機制，為臨床診斷和治療提供理論依據。

本實驗利用低濃度凝膠電泳去除血漿中高豐度的白蛋白，以獲得豐度相對較低的高分子蛋白。對收集的所有144例不育患者與正常人的血漿蛋白進行凝膠分離并利用凝膠成像系統分析對比差異，結果發現在高分子量血漿蛋白中，有兩條明顯的差異條帶(約為200 kD及120 kD處)，質譜鑒定結果為補體C3。

補體是一組具有酶原活性的糖蛋白，C3在補體系統中含量十分豐富，且發揮重要作用。補體C3可被抗原－抗體復合物及其他許多因子所激活，從而產生相應的生物學效應。在生殖系統中也有相關的研究報道，在女性不育伴有子宮內膜異位患者中，血清補體C3、C4及SC5b－9補體復合物處于高水平。不育男性精漿C3含量高于正常生育男性［6，7］。本研究發現男性不育患者血漿中補體C3條帶染色深于正常捐精者蛋白條帶，但血漿中準確的含量變化還有待驗證。通過SWISS－PROT蛋白數據庫檢索到的補體C3理論分子量大約為190kD，由于補體C3本身是一種糖蛋白，有一定的糖基修飾，故本實驗凝膠結果顯示接近200kD處的條帶應為補體C3。另外，補體C3在機體的補體系統中發揮作用時，往往有不同的片段形式［6］，這也解釋了實驗結果中條帶b(圖1)的存在。

本實驗利用簡單的低濃度SDS－PAGE分離技術，對血漿高分子量蛋白進行分離，發現了補體C3在不育患者與所選捐精者血漿中的差異，該現象提示不育患者的血漿蛋白出現了一定的變化，但相關機制及其與精漿/精液質量的相關性有待進一步驗證。我們將通過繼續擴大樣本量及定量檢測補體C3的血漿含量變化，以對補體C3蛋白條帶的差異做進一步研究。

1 Povey AC，Stocks SJ.Epidemiology and trends in males fertility［J］.Hum Fertil，2010，13(4):182－188.

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3 World Health Organization.WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen［M］.5th ed.Geneva:World Health Organization，2010.

4 Veenstra TD，Conrads TP，Hood BL，et al.Biomarkers mining the biofluid proteome［J］.Mol Cell Proteomics，2005，4(4):409－418.

5 Xiao Z，Prieto D，Conrads TP，et al.Proteomic patterns their potential for disease diagnosis［J］.Mol Cell Endocrinol，2005，230(1－2):95－106.

6 Kabut J，Kondera－Anasz Z，Sikora J，et al.Levels of complement components iC3b，C3c，C4，and SC5b－9 in peritoneal fluid and serum of infertile women with endometriosis［J］.Fertil Steril，2007，88(5):1298－1303.

7 Harris CL，Mizuno M，Morgan BP.Complement and complement regulators in the male reproductive system［J］.Mol Immunol，2006，43(1－2):57－67.