ECLIA法與RRA法檢測血清促甲狀腺激素受體抗體的對比研究

彭鳴亞 徐龍寶 鄧民斌 薄靜莉 楊其賢

（常州市第二人民醫院核醫學科，江蘇 常州 213003）

Graves病（Graves disease，GD）是一種器官特異性自身免疫性疾，是在環境因素與遺傳因素相互作用下，機體免疫統對自身成分發生免疫應答而導致的疾病狀態，GD時體內存在多種自身抗體，如促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）、甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）、甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）等，而在GD患者中TRAb的陽性率能達到95%以上，其在GD發病機制中起著關鍵的作用，因此準確檢測患者血清TRAb顯然有助于甲狀腺疾病的鑒別診斷，并對Graves病療效評價及病程監測和預后有重要的價值。長期以來，臨床上血清TRAb的檢測基本采用放射受體分析方法（RRA）或ELISA這兩種手工檢測方法，雖然這兩種方法具有結果較精確，經濟成本低等優點，但也存在檢測耗時較長，操作過程不可控因素相對比較多，檢測的質量控制相對不穩定，對操作者技術要求較高等制約因素。近來，羅氏診斷公司已采用全自動電化學發光免疫方法（ECLIA）檢測TRAb，其顯著的優點是操作簡便、快捷。國際多中心研究報告提示該方法也有較高的診斷靈敏度和特異性[1]。本文擬將ECLIA與天津協和醫藥科技有限公司提供的RRA試劑進行對比分析，以驗證ECLIA法檢測TRAb的可行性和臨床實用性。

1 對象與方法

1.1 對象

正常對照組158例，其中男51例，女107例。年齡范圍18～83歲，均為健康體檢者，無甲狀腺疾病史，實驗室甲狀腺功能檢查均正常。Graves病組159例，其中男49例，女110例，年齡范圍16～82歲，均為門診初診患者，實驗室甲狀腺功能檢查均異常。

1.2 方法

ECLIA采用Roche Cobas600全自動電化學發光免疫分析系統及配套試劑（羅氏診斷公司，德國）。檢測原理為：通過一種生物素標記的抗豬促甲狀腺激素受體（TSHR）小鼠單克隆捕獲抗體，將可溶豬TSHR固定于鏈霉親和素包被的微粒上，捕獲抗體結合于豬TSHR的C末端，不會干擾TRAb或人TSHR刺激單克隆抗體（M22）與TSHR的結合，通過檢測TRAb抑制釕標記M22結合TSHR的能力進行測定。實驗所需的樣本容量為50μL，總體實驗時間27min。測定范圍0.3～40IU/L。

RRA方法檢測采用天津協和醫藥科技有限公司提供的RRA試劑盒，檢測原理為：由于TRAb能阻礙TSH與TSH受體的結合，因此將TSH受體與血清125I-TSH標記物一起溫育，TRAb與標記物競爭結合受體的部位，因此若TRAb滴定度較高，則125I-TSH結合受體就較低。溫育后加入沉淀劑使受體-標記物復合物沉淀，離心后棄上清，測量沉淀物的放射性強度從而得出TRAb的值。實驗所需的樣本容量為50μL，總體實驗時間3h。測定范圍0.5～40.5IU/L。

所有受檢者均以血清管采清晨空腹靜脈血3mL，待血液凝固后分離血清，2～8℃保存，并于48h內采用ECLIA和RRA兩種方法檢測TRAb，同一份血清分別采用雙管檢測后取其平均值作為檢測值。

取低濃度與高濃度TRAb血清樣本，分別以ECLIA和RRA方法重復測定10次，計算各自測量值、標準差及變異系數。

1.3 統計學處理

采用SPSSl3.0統計軟件，計算正常人群的第97.5百分位數（P97.5）作為TRAb正常參考值的上限，根據該值對樣本進行陰陽性分類，差異性比較采用McNemar檢驗，兩種檢測方法所得結果之間采用Wilcoxon配對比較，相關分析采用Spearman秩相關。

2 結 果

2.1 診斷符合率

取正常對照組者檢測結果的P97.5作為TRAb正常參考值的上限，ECLIA法與RRA法分別為1.37IU/L與2.01IU/L，以此對159對甲狀腺功能亢進患者的檢測結果進行陰陽差異性分類，結果見表1，兩種檢測方法均呈陽性為127例，（占ECLIA總陽性的94.8%）均呈陰性為20例（占ECLIA總陰性的80.0%），ECLIA陽性而RRA陰性7例，ECLIA陰性而RRA陽性5例，總診斷符合率86%，McNema分類差異P=0.896，無統計學意義，分類一致性Kappa值為0.845（P＜0.01）。結果說明兩種檢測方法的檢測結果對臨床判斷雖有差異，但整體判斷較一致，影響不大。

表1 兩種方法檢測結果

2.2 兩種方法檢測TRAb值的相關性

兩種檢測方法對所有實驗血清樣品TRAb對比檢測結果顯示：Roche ECLIA的TRAb檢測數值明顯低于RRA檢測值，經統計學處理后得出兩種方法Wilcoxon配對檢驗Z值為－9.258（P＜0.01），提示兩種方法的檢測值之間存在統計學差異，但兩種方法得出的檢測值的Spearman相關系數為0.792（P＜0.01），提示兩種TRAb檢測方法的整體相關性良好。

2.3 精密度

選取TRAb低濃度血清（ECLIA法檢測值為1.98IU/L，RRA法檢測值為2.45IU/L）與TRAb高濃度（ECLIA法檢測值為29.8IU/L，RRA法檢測值為31.2IU/L）重復測量10次，計算各自的變異系數，ECLIA法：低濃度TRAb的變異系數：3.7%，高濃度TRAb的變異系數：1.2%。RRA法：低濃度TRAb的變異系數：12.7%，高濃度TRAb的變異系數：7.4%。ECLIA法檢測TRAb的穩定性較RRA法明顯好，且兩種方法在檢測血清高濃度TRAb的穩定性均較檢測血清低濃度TRAb好。

3 討 論

血清TRAb的濃度，對GD引起甲狀腺外表現和其他甲狀腺疾病的診斷、評估療效、確定停藥時機、預測復發及鑒別高危人群等方面又中藥的臨床意義，因此，TRAb的檢測方法直接影響著臨床對甲狀腺疾病的判斷、治療等，目前TRAb的檢測方法主要有兩類，即受體分析法及生物分析法[2]。臨床上應用較廣的是RRA法和ELISA法，而這兩種方法均存在檢測速度慢，人為影響因素多等實際問題，羅氏公司基于生物分析法的原理，將TRAb納入ECLIA系統，去除了人為影響因素，并縮短了檢測時間，提高了檢測效率。

本研究結果顯示：RRA法與ECLIA法在檢測同一份血清TRAb時，檢測值有明顯的差異，產生這種差異性的原因很多，考慮以下因素最有可能：TRAb本身屬于多克隆混合抗體性質，兩種方法所選擇的TSHR來源不同，免疫結合在識別位點上不同，由此造成檢測結果形成差異，因此，在使用不同方法檢測血清TRAb時，有必要確定不同方法的正常參考值，否則，則有可能對患者個體檢測結果產生顯著影響，這一點應引起實驗室和臨床醫師的重視。當臨床判斷預期與實驗室TRAb分析結果相矛盾時，除進行必要的誤差分析外，尚需注意其正常參考值的設定是否正確。

由于加樣準確、檢測條件穩定等多種因素，自動化檢測的優勢之一在于免疫檢測的精密度和穩定性比手工方法好[3]，本研究的結果也證實了這一點。在進行的簡化批內誤差分析實驗中，我們注意到無論是低值還是高值，ECLIA批內變異系數均較RRA法小，顯示出ECLIA法在精密度和穩定性方面的優異表現。

由于實驗條件限制，本研究局限性在于尚沒有對ECLIA檢測TRAb進行系統性的回收率測定，由于ECLIA和RRA方法對TRAb的有效檢測量程均有限（分別為＜40IU/L及＜40.5IU/L），因此臨床上經常出現患者TRAb血清濃度高出測量上限（本研究中包含13個病例），因此，在遇到這種情況時，需要對樣品進行稀釋后進行檢測，而免疫檢測中高濃度樣品的稀釋往往不成線性，因此常無法判斷GD病的危險度和對治療效果進行監測，因此，若能進一步實驗證實ECLIA法的回收率較高，則能進一步顯示ECLIA法的優勢。

由于時間限制，本研究的其他局限性還包括在標本的收集方面不太完善，未能獲得甲狀腺功能亢進患者全面的診斷和治療隨訪的全面信息，同時對于臨床判斷的正常參考值僅限于為本研究的表面健康人群，未經過大樣本的臨床研究得到最終確定。至于血清內其他成分如甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）和甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）等因素對TRAb檢測值的影響也需要實驗室驗證。

無論如何，采用ECLIA檢測TRAb的方法學優勢顯著。該方法檢測速度快，整個檢測過程不超過30min，能使患者和臨床醫生快速取得檢測結果，為臨床治療提供即刻信息。臨床實驗室采用免疫自動化方法檢測TRAb將成為一種趨勢[4]。

[1] Sehott M,Hermsen D,Broecker-Preuss M,et a1.Clinical value of the first at Jtol/I,tlted TSH receptor a atoantibody assay for the diagnosis of Groves’ disease(GD):an international muhieentre tRRAl[J].Clin Endocrinol,2009,71(8):566-573.

[2] 周亞芹,蘇青.促甲狀腺素受體抗體的檢測方法[J].放射免疫學雜志,2009,22(1):40-43.

[3] Yoshimura NJ,Miyazaki N,Ito K,et a1.Evaluation of a new rapidand fully automated electrochemiluminescence immunoassay for thyrotropin receptor autoantibedies[J].Thyroid,2009,18(10):1157-1164.

[4] Hermsen D,Broecker-Preuss M,Casati M,et a1.Technical evaluation of the firstfully automated assay for the detection of TSH receptor autoantibodies[J].Clinica Chemiea Acts,2009,40(1/2):84-89.