大鼠實驗性腦外傷后核因子κB活化與細胞凋亡的關系研究

孫江紅 郭相杰

（1 山西省高級人民法院證據技術中心，山西 太原 030024；2 山西醫科大學法醫學院病理教研室，山西 太原 030001）

腦外傷（traumatic brain injury，TBI）是法醫實踐中最常見的暴力死亡因素，腦外傷會引起一系列的病理、生理、生化方面的改變，如蛛網膜下腔出血、顱內血腫、腦水腫、腦循環障礙等，造成腦的二次損傷和多次損傷。腦外傷的發生發展、損傷形成的機制、損傷程度的分析以及預后判斷一直受到法醫工作者的重視，其中損傷程度的判定成為判定案件性質及量刑的主要依據[1,2]。

目前對腦外傷細胞水平的研究多集中在腦外傷后神經元細胞的凋亡。近年來一系列尸檢腦組織標本及的腦外傷動物模型研究證實，TBI后細胞凋亡參與了繼發性腦損傷的發展過程，細胞凋亡與腦外傷密切相關。許多研究表明，繼發性神經元死亡有10%～50%是神經元凋亡引起的。神經元凋亡生在創傷灶的中心部位外，主要出現在傷灶4周的缺血、缺氧區，即所謂遲發性神經元死亡[2-5]。

腦外傷后還涉及一系列細胞因子的變化，包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、核因子κB （neucler factorκB，NF-κB）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等，這些細胞因子的相互作用在很大程度上決定了損傷的發展及嚴重程度。NF-κB是近年發現的最重要的轉錄因子之一，正常情況下胞漿內與抑制蛋白（IκB）結合而呈非活性狀態。當細胞受到各種刺激原如紫外輻射、細胞因子（如TNF-α、IL-1）、損傷時，NF-κB與IκB解離并進入細胞核內，與特定的啟動子結合，從而調控各種基因的表達，如細胞因子、炎性因子、黏附分子等。NF-κB在炎癥發生時復雜的細胞因子網絡中起著中心調節作用。腦外傷后NF-κB的激活及其調節，正是近年來的研究熱點之一[6-8]。

由此可見，腦外傷后細胞凋亡的發生及NF-κB活化是決定腦外傷損傷程度的兩個重要因素。本研究以實驗性腦外傷大鼠為模型，對外傷后不同時間的凋亡發生及NF-κB的活化進行檢測，考察二者的關系，同時對NF-κB活化進行干預，以明確NF-κB與凋亡發生的關系，從而對腦損傷程度的鑒定提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

將72只Wistar大鼠隨機分成24個小組，每組3只，其中8組作為對照組8組，8組作為實驗組，8組作為PDTC（Pyrrolidine dithocarbamate）組，PDTC（Sigma）預先按100mg/kg體質量腹腔注射。實驗組及PDTC組大鼠制造腦外傷模型[2]。對照組制造假損傷，僅切開頭皮、右頂部開骨窗，不致腦外傷。

各組動物分別在腦外傷后0h、1h、6h、12h、24h、48h、72h、168h斷頭，取出整腦，沿挫傷灶中央作冠狀切面取材（包括未損傷的左側腦組織），前半部分腦組織用液氮冷凍后放人-70℃冰箱保存備用，后半部分腦組織固定于4%多聚甲醛0.1mol/L PBS溶液中24h，用石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1 TUNEL 鑒定細胞凋亡

應用TUNEL試劑盒（Roche）原位標記凋亡細胞，按說明書操作，對以挫傷灶為中心60°腦域內TUNEL陽性細胞進行圖像分析，以計算凋亡細胞的比例。

1.2.2 凝膠電泳遷移率變遷分析（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）鑒定NF-κB的活化

收集腦組織，抽提核蛋白，按說明書加入20～50 fmol的32P 標記（30000～50000cpm）的NF-κB特異寡核苷酸探針（5AGTTGAGGGGA CTTTCCCAGGC3），混勻后室溫下孵育10min，SDS PAGE電泳，電泳畢凝膠轉移至濾紙上，覆X線片暗房中曝光72h，顯影后作圖像分析。

1.2.3 統計學處理

所有數據均以均數±標準差（χ—±s）表示，采用SPSS13.0統計軟件包對所得數據進行t檢驗和單因素方差分析，取P＜0.05表示統計結果具有顯著性差異。

2 結 果

2.1 腦外傷引起細胞凋亡

結果顯示，實驗組在腦外傷24h后損傷腦域內出現明顯的細胞凋亡，到48h到達峰值，然后逐漸回落，與對照組相比，24h、48h、72h、168h均有顯著差異（P＜0.05）；對照組一直未出現明顯的細胞凋亡（圖1）。

圖1 大鼠實驗性腦外傷后不同時間神經凋亡細胞的比例 （±s， n=3）

2.2 腦外傷引起NF-κB的活化

結果顯示，創傷組在腦外傷1h后NF-κB開始活化，到24h到達峰值，然后逐漸回落；同時，對照組NF-κB活性也出現了升高-降低的動態變化，但幅度較小。實驗組與對照相比，1h、6h、12h、24h、48h、72h均有顯著差異（P＜0.05）（圖2）。

圖2 大鼠實驗性腦外傷后不同時間NF-κB的活性 （±s，n=3）A：EMSA顯示24h NF-κB活化情況；B：直方圖

2.3 PDTC 可加劇腦外傷引起的細胞凋亡

PDTC是NF-κB特異抑制劑，結果顯示，在PDTC應用組，凋亡細胞比例明顯增加，PDTC組與未加PDTC組相比，24h、48h、72h、168h均有顯著差異（P＜0.05）；同時，PDTC組凋亡的發生亦隨時間發生了“升高-降低”的變化

3 討 論

本研究結果顯示，在急性腦外傷后，大鼠受傷腦域內隨時間出現了大量的凋亡細胞，但隨著時間進一步發展，凋亡細胞比例又逐漸下降，造成這一現象的原因可能是多方面的，比如有一部分凋亡細胞最終壞死崩解，或者一部分早期的凋亡細胞其凋亡被逆轉。這些結果提示我們，凋亡可以作為腦損傷程度判定的一個因素。在法醫實踐中，可以運用TUNEL法對尸檢腦組織鑒定凋亡細胞的比例，從而增加腦損傷判定以及損傷時間推測的依據，目前實際上已經開展了這方面的工作[9]。

本研究還顯示，NF-κB的活化出現在腦損傷的早期，并且NF-κB特異抑制劑PDTC可以增加凋亡細胞的比例，說明在腦損傷過程中，NF-κB具有保護細胞免于凋亡的功能。綜合考慮NF-κB活化程度與細胞凋亡的比例，可為判斷腦損傷時間提供很多有益的信息。但同時其他研究顯示，在腦損傷所致的腦水腫、炎癥過程中，NF-κB起到關鍵的促進作用[10]，因此可以說在腦外傷后，NF-κB的活化是一把“雙刃劍”。這就提示我們，在法醫實踐中，應慎重對待NF-κB活化這一指標，應進一步對NF-κB所調控的細胞因子進行鑒定，才能夠全面地判定腦損傷的程度和時間。

圖3 PDTC可增加腦外傷后的細胞凋亡（±s, n=3）

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