伊貝沙坦對胰島素抵抗大鼠腎組織bFGF的影響

牛凱 劉冰 王利軍 郭嵐

正常情況下，體內(nèi)多種因子及酶能調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，使它們處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦平衡被打破，使得細(xì)胞外基質(zhì)過度合成、沉積和(或)降解受抑制，即可導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。小管間質(zhì)纖維化程度預(yù)示著腎功能受損的程度，在腎臟疾病轉(zhuǎn)歸中起重要作用，決定慢性腎臟病患者的預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠，采用胰島素抵抗大鼠動(dòng)物模型，通過檢測堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)在腎組織的表達(dá)，研究伊貝沙坦沙坦在腎間質(zhì)纖維化中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雄性SD大鼠32只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為對照組，模型組，伊貝沙坦50mg/kg、100mg/kg干預(yù)組，每組8只。模型組以高脂高糖飼料喂養(yǎng)，對照組一直予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。干預(yù)組中伊貝沙坦(法國Sanofi公司提供)溶于蒸餾水按體重灌胃，飼料喂養(yǎng)與模型組相同。喂養(yǎng)12周后處死動(dòng)物，觀察結(jié)果。

1.2 收縮壓(SBP)的測定 在每周日早晨8∶00～10∶00將大鼠在箱中預(yù)熱38℃，10min后，用尾袖法測量大鼠尾動(dòng)脈血壓。

1.3 空腹血糖(FBG)、胰島素(FINS)測定 喂養(yǎng)12周后，大鼠禁食12 h過夜，血糖儀檢測空腹血糖(FBG);酶聯(lián)免疫法測定血清胰島素(FINS);計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，公式為(Ins×FBG)/22.5，統(tǒng)計(jì)時(shí)取自然對數(shù)使其符合正態(tài)性，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 病理學(xué)檢查 SD大鼠處死后立即取腎臟組織液氮冷凍，－70℃保存。取腎臟組織，固定，包埋，切片觀察病理改變。采用免疫組化法分別測定腎組織中bFGF，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。通過顯微攝像系統(tǒng)采集圖像，取每個(gè)視野“陽性區(qū)平均光密度”的均數(shù)作為所測得的光密度值。并取平均數(shù)，即得腎小管間質(zhì)bFGF的表達(dá)均值，最后根據(jù)各組陽性表達(dá)的均值作比較。采用免疫組織化學(xué)法檢測bFGF在腎間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)情況。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。陽性點(diǎn)在光學(xué)顯微鏡呈黃色至棕褐色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠的血壓變化 模型組收縮壓較對照組、伊貝沙坦50干預(yù)組高，伊貝沙坦100組血壓明顯低于于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。見圖1。

圖1 4組大鼠喂養(yǎng)12周血壓變化

2.2 4組大鼠 FBG、FINS、HOMA-IR和bFGF變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)4組動(dòng)物FBG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。模型組FINS水平顯著高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。模型組HOMA-IR明顯高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。對照組大鼠腎臟中的bFGF僅在腎間質(zhì)細(xì)胞中見少量表達(dá)。模型組大鼠腎組織中腎間質(zhì)細(xì)胞中可見大量棕黃色顆粒，腎間質(zhì)中bFGF陽性表達(dá)明顯增多。伊貝沙坦50組bFGF陽性表達(dá)明顯低于模型組，伊貝沙坦100組bFGF陽性表達(dá)明顯低于伊貝沙坦50干預(yù)組(P ＜0.01)。見表1。

表1 4組FBG、INS、ISI和bFGF比較 n=8，

表1 4組FBG、INS、ISI和bFGF比較 n=8，

注:與對照組比較，*P ＜0.05，與模型組比較，#P ＜0.01;與伊貝沙坦50組比較，△P ＜0.01

對照組△△

3 討論

腎小管間質(zhì)纖維化，是一種獨(dú)立于病因之外的持續(xù)進(jìn)展過程，并是各種原發(fā)或繼發(fā)性腎臟疾病不斷進(jìn)展，導(dǎo)致腎臟正常組織結(jié)構(gòu)被細(xì)胞外基質(zhì)所取代，并伴隨腎臟功能不可逆損害的病理過程［1］，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的共同通路，且腎功能減退與腎間質(zhì)纖維化程度密切相關(guān)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為bFGF對成纖維細(xì)胞有很強(qiáng)的促細(xì)胞分裂增殖活性，TGF-β1和bFGF在刺激腎間質(zhì)基質(zhì)過程中有著重要作用［2］。

本研究發(fā)現(xiàn)，高脂高糖喂養(yǎng)造成大鼠的血壓升高，F(xiàn)INS升高，HOMA-IR也明顯升高，而空腹血糖無明顯差別。研究結(jié)果說明高脂高糖喂養(yǎng)組大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)已造成胰島素抵抗，處于高胰島素血癥和葡萄糖耐量異常的時(shí)期，但尚未進(jìn)展為糖尿病，接近原發(fā)性高血壓胰島素抵抗的模型［3］，造模成功。

FGF是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽，其中bFGF是研究最廣、最具有生物效應(yīng)、也是作用最廣泛的成纖維細(xì)胞生長因子之一;bFGF主要作用調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。bFGF廣泛存在于多種組織中，能夠以分泌的方式促使系膜細(xì)胞增殖及其產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)［4］，bFGF是一種非糖基化糖鏈多肽，因其具有刺激成纖維細(xì)胞分裂增殖作用而得名。研究表明腎小管上皮受損可刺激bFGF的過度分泌，bFGF可通過自分泌和旁分泌機(jī)制引發(fā)腎小管上皮和間質(zhì)細(xì)胞增生及進(jìn)一步分泌bFGF，進(jìn)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生以及膠原合成，從而促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化［5］。

bFGF是以自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮作用，并有可能通過不依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—高爾基體通路的細(xì)胞胞吐作用將其釋放至胞外，并作用于靶細(xì)胞。成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，bFGF能夠刺激細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成，故在腎小管間質(zhì)纖維化過程中起重要作用。正常腎組織的腎小球、腎血管、間質(zhì)及部分腎小管的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞內(nèi)有bFGF蛋白及mRNA的低表達(dá)。在本研究中，對照組大鼠腎臟中的bFGF僅在腎間質(zhì)細(xì)胞中見少量表達(dá)，腎小球細(xì)胞無表達(dá)，但在模型組大鼠腎組織中腎間質(zhì)和腎小管上皮細(xì)胞中可見大量棕黃色顆粒，表明隨著腎間質(zhì)纖維化的程度加重bFGF的表達(dá)而增加。伊貝沙坦組bFGF陽性表達(dá)明顯低于模型組，大劑量伊貝沙坦對bFGF陽性表達(dá)明顯低劑量組，顯示伊貝沙坦對腎間質(zhì)bFGF的表達(dá)有抑制作用，伊貝沙坦大劑量對腎間質(zhì)纖維化有抑制作用。

1 Grande MT，Lopez-Novoa JM.Fibroblast activation and myofibroblast generation in obstructive nephropathy.Nat Rev Nephrol，2009，5:319-328.

2 Pawlak J，Klim B，Szkudlarek M，et al.The formation of new blood vessels in coronary artery disease:where we are now.Postepy Hig Med Dosw，2004，58:358-363.

3 Shridhar NI，Michael JK.Effect of acute and chronic Irbesartan treatment on glucose tolerance and insulin sensitivity in fructose-fed rats.Am J Hypertens，1996，9:662-668.

4 Liu XH，Zhao XM.Perlecan participates in the protection of ischemic myocardium induced by basic fibroblast growth factor:experiment with rats.National Med J China，2007，87:1857-1861.

5 徐曼.成纖維細(xì)胞生長因子及受體在腎小管間質(zhì)纖維化過程中的表達(dá).重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，24:239-241.