錯配修復基因hMLH1在口腔鱗狀細胞癌中的表達及意義

谷建琦 王會恩 謝麗麗 張英懷

口腔癌是頜面部最常見的惡性腫瘤，手術(shù)是其最主要的治療方法之一。隨著研究的深入，目前認為口腔癌是一種多基因性疾病，其發(fā)生通常與一個或數(shù)個基因的突變相關(guān)，通過基因表達水平或蛋白特性的改變，導致被編碼蛋白功能發(fā)生異常，干擾細胞的功能，從而加速了腫瘤形成的過程。近年來錯配修復基因hMLH1與口腔癌的關(guān)系日益受到學者們的矚目。本研究采用免疫組化方法研究hMLH1在口腔鱗狀細胞癌的表達及其意義，探討hMLH1在口腔鱗狀細胞癌發(fā)生中的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗組:收集河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院1991至2004年口腔鱗狀細胞癌蠟塊標本69例，其中男32例，女37例;年齡13～79歲，平均年齡56.61歲;牙齦癌30例，舌癌19例，頰癌10例，口底癌3例，腭癌7例;高分化34例，中分化20例，低分化15例。所有患者均為術(shù)前未經(jīng)放療及化療的初發(fā)病例。對照組:正常口腔黏膜組織40例，其中男22例，女18例;年齡11～68歲，平均年齡31.30歲。為囊腫等良性腫瘤旁的正常黏膜組織。以上每例標本均進行HE染色后經(jīng)有經(jīng)驗的病理醫(yī)師閱片后確診。

1.2 試劑 hMLH1及二抗購于武漢博士德生物工程有限公司，使用濃度1∶75。SP免疫組化試劑盒，DAB顯色劑，多聚賴氨酸(Poly-L-lysine)防脫片劑均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 采用免疫組織化學SP法。將每個蠟塊切為4～5 μm的切片，共切3張，1張HE染色，1張 hMLH1染色，1張作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 hMLH1陽性結(jié)果判定:以細胞核或漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性，結(jié)果評定參照Lorenzo Lo Muzio標準［1］，每張切片在光鏡下隨機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個癌細胞，觀察陽性細胞數(shù)，＜5%為陰性(－)，＞5%為陽性(+)。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，出現(xiàn)小值頻數(shù)時，采用Fisher精確概率法，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 hMLH1在正常口腔黏膜組織和OSCC組織的表達 在正常口腔黏膜組織中，hMLH1陽性細胞定位于胞漿，呈棕黃色顆粒(圖1)，出現(xiàn)于大部分黏膜上皮，部分病例中同時出現(xiàn)胞核著色，呈現(xiàn)為核漿型，著色較淺，且分布均勻。陽性細胞以上皮基底層密集且深染。在OSCC組織中，hMLH1的表達主要位于癌細胞的胞漿內(nèi)，少部分胞核也有表達，為棕黃色顆粒染色(圖2、3)。hMLH1在OSCC組織中的表達率為47.8%，在對照組的表達率為77.5%，而且多為強陽性表達，與實驗組的陽性表達率之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

圖1 正常口腔黏膜組織中hMLH1染色為強陽性(SP×200)

圖2 hMLH1在高分化口腔鱗癌組織中的表達(SP×200)

圖3 hMLH1在中分化口腔鱗癌組織中的表達(SP×200)

2.2 hMLH1的表達與患者的臨床病理學指標的關(guān)系 hMLH1的表達與患者的性別、年齡以及腫瘤的部位無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，只與腫瘤的分化程度相關(guān)，分化程度越低，hMLH1的失表達越明顯(P ＜0.05)。見表2。

3 討論

錯配修復(mismatch repair，MMR)基因是一組高度保守的看家基因，其主要功能是特異性識別和修復DNA復制過程中出現(xiàn)的堿基錯配，保證DNA復制的高保真度，維持基因組穩(wěn)定性。

表1 hMLH1在正常口腔黏膜組織與口腔鱗狀細胞癌中的表達 例

表2 hMLH1的表達與患者的臨床病理學指標的關(guān)系 例

微衛(wèi)星是廣泛散布在整個染色體基因組中的一種特殊的DNA序列，其核心序列為1～6個核苷酸，核心序列可重復8次或更多，串聯(lián)即構(gòu)成微衛(wèi)星。由于微衛(wèi)星的這個結(jié)構(gòu)特點，所以易于在復制過程中出現(xiàn)“鏈滑”現(xiàn)象，從而出現(xiàn)錯配［2］。若得不到及時糾正，則導致自鏈與模鏈板重復單位的重復次數(shù)不等，表現(xiàn)為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性增加，反映出整個基因組的不穩(wěn)定狀態(tài)［3，4］。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)是錯配修復基因缺陷的特征性表現(xiàn)，所謂微衛(wèi)星不穩(wěn)定是指由于復制錯誤引起的簡單重復序列的改變。正常情況下，DNA在復制過程中經(jīng)常會發(fā)生錯誤，但會被細胞自身的防衛(wèi)機制如錯配修復基因所糾正，不會影響基因的正常結(jié)構(gòu)。而在疾病狀態(tài)下(如腫瘤)，細胞內(nèi)錯配修復基因發(fā)生突變，直接造成錯配修復機理的破壞，進而發(fā)生MSI，最終可能發(fā)生基因結(jié)構(gòu)上的變化，從而導致腫瘤。

Lorenzo等［1］用免疫組化的方法分析20例口腔鱗狀細胞癌及5例正常口腔黏膜組織中hMLH1的表達，結(jié)果5例正常口腔黏膜組織均為陽性表達，在基底細胞層和基底旁細胞層核染色強陽性，角化層無染色，并且2例伴有漿染色。而在口腔磷狀細胞癌中，hMLH1有10例核染色。研究認為，hMLH1蛋白表達的檢測在口腔鱗狀細胞癌的檢測中發(fā)揮重要的作用，hMLH1的缺失可能為口腔鱗狀細胞癌的潛在特點。

本研究結(jié)果顯示:在40例正常口腔黏膜中有31例hMLH1為強陽性表達，為胞漿染色，并且在基底細胞層和基底旁細胞層顯示為強染色，而在表皮層無染色。而在69例口腔鱗狀細胞癌中，hMLH1有33例陽性表達，且為漿染色，這與Lorenzo有所不同，并且本實驗無論正常對照組還是試驗組的陽性率均較文獻［1］低，考慮與所取樣本數(shù)目多少有極大關(guān)系，還可能與腫瘤的組織分型、免疫組化技術(shù)等多種因素有關(guān)。

本實驗陽性率與年齡、性別及部位無關(guān)，只與分化程度相關(guān)，隨分化程度的降低，hMLH1的表達有降低趨勢，在低分化口腔鱗狀細胞癌中基本無表達。這在口腔鱗狀細胞癌的研究中未見相關(guān)報道，有關(guān)其它腫瘤的文獻報道不一。

Shin等［5］研究認為，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在口腔鱗狀細胞癌和涎腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，hMLH1遺傳基因的改變或hMLH1促甲基化可能是口腔鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的原因。Viswanathan等［6］也認為，hMLH1的促甲基化導致失活在口腔鱗狀細胞癌中比較常見，異常甲基化的檢測可作為診斷OSCC的高危險因素。

Han等［7］發(fā)現(xiàn)低分化腺癌中MSI陽性率為64%，高分化腺癌中MSI陽性率為17%，低分化腺癌中MSI發(fā)生率顯著高于高分化腺癌，這與本實驗結(jié)果一致。但Kruschewski等［8］在研究SCC時發(fā)現(xiàn)hMLH1與hMSH2蛋白表達缺失與腫瘤的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。

在本研究中，我們從錯配修復缺陷的角度探討了口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展機制，這有助于我們進一步了解MMR的生理功能及其對細胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)作用等生物學行為，以及在人類腫瘤發(fā)生中的機制，但hMLH1對口腔鱗狀細胞癌發(fā)生的作用大小，所處的地位及與其它諸多基因改變的復雜關(guān)系等尚不完全清楚，還有待于進一步研究。

1 Lorenzo LM，Pierfrancesco N，Michele D，et al.Immunocytochemical detection of hMSH2 and hMLH1 expression in oral SCC.Anti Res，1999，19:933-940.

2 丁一，童坦軍.微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的生物學意義及其應用前景.生理科學進展，1999，30:292-296.

3 Fleisher AS，Esteller M，Wang S，et al.Hepermethylation of hMLH1 gene promoter in human gastric cancers with microsatellite instability.Cancer Res，1999，59:1090-1095.

4 Halling KC，Harper J，Moskaluk CA，et al.Origin of microsatellite instability in gastric cancer.Am J Pathl，1999，155:205-211.

5 Shin KH，Park KH，Hong HJ.Prevalence of microsatellite instability，inactivation of mismatch repair genes，p53 mutation，and human papillomavirus infection in Korean oral cancer patients.Int J Oncol，2002，21:297-302.

6 Viswanathan M，Tsuchida N，Shanmugam G.Promoter hypermethylation profile of tumor-associated genes p16，p15，hMLH1，MGMT and E-cadherin in oral squamous cell carcinoma.Int J Cancer，2003，105:41-46.

7 Han HJ，Yanagisawa A，Kato Y，et al.Genetic instability in pancreztic cancer and poorly differentiated type of gastic cancer.Cancer Res，1993，53:5087-5089.

8 Kruschewski M，Noske A，Haier J，et al.Is reduced expression of mismatch reqair genesmlH1 and MSH2 in patients with sporadic colorectal cancer related to their prognosis.Clin Exp Metastasis，2002，19:71-77.