大劣按蚊感染約氏瘧原蟲defensins基因的克隆及生物信息學(xué)分析

張錫林,王英,陳繼德,宋蓓

(第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病原生物學(xué)教研室 重慶,400038)

蚊蟲是人類感染疾病的重要傳播媒介,能傳播瘧疾、淋巴絲蟲病和多種蟲媒病毒病。昆蟲對(duì)各種病原體的入侵也會(huì)產(chǎn)生防御性免疫反應(yīng),產(chǎn)生的抗菌肽已被分離、鑒定[1],防御素(defensin)為其中的一大類,是廣泛存在于生物界具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽,它對(duì)G+細(xì)菌、分枝桿菌、真菌和某些有包膜的病毒均有殺滅作用,對(duì)除了大腸桿菌外的G-細(xì)菌幾乎無活性[2]。Defensins最早是從兔的肺泡巨噬細(xì)胞中分離出來,而昆蟲的defensins最早是從果蠅中發(fā)現(xiàn)的[3]。蚊的defensins基因首先從埃及伊蚊體內(nèi)分離出來的,迄今為止已發(fā)現(xiàn)了40多種昆蟲defensins[4]。

大劣按蚊是東南亞地區(qū)和我國海南地區(qū)瘧疾的主要傳播媒介。按蚊的防御反應(yīng)可通過激活黑化包被反應(yīng),殺死病原體。NO和抗菌肽的產(chǎn)生等機(jī)制可抑制體內(nèi)瘧原蟲的發(fā)育。目前發(fā)現(xiàn)的瘧原蟲誘導(dǎo)按蚊產(chǎn)生的抗菌肽主要是防御素(defensins)[5],因此研究按蚊defensins的結(jié)構(gòu)與功能,將有助于提高蟲媒病的防治水平。本文以大劣按蚊雌蚊為材料,分別以約氏瘧原蟲進(jìn)行誘導(dǎo),對(duì)其體內(nèi)defensins進(jìn)行克隆及序列生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘧原蟲和按蚊 約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)BY265株為本實(shí)驗(yàn)室保存的蟲株:每周用昆明株小鼠血傳 1次,每5周蚊傳1次。大劣按蚊(Anopheles dirus)海南株:由本實(shí)驗(yàn)室在(24±0.5)℃、相對(duì)濕度(70±5)%的養(yǎng)蚊室飼養(yǎng),供實(shí)驗(yàn)使用。

1.1.2 菌株 大腸桿菌(Escherirchia coli DH 5α)由第三軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室提供。

1.1.3 主要試劑 T ripure試劑購自羅氏公司;MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、DEPC為Promega公司產(chǎn)品;Oligo d(T)15 、TaqDNA 聚合酶 、dNTP、DNA Marker 和pMD18-T載體試劑盒購自Takara公司。DNA凝膠回收試劑盒,IPTG、X-gal購于上海博亞、氨芐青霉素,溴化乙錠為Sigma產(chǎn)品,其余試劑均為國產(chǎn)的分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)已發(fā)表的岡比亞按蚊防御素基因序列[6],以及昆蟲防御素具有保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)合成一對(duì)簡并引物def f1:5＇-TGC ATT TCG(AG)CA(GC)AC(GA)CA(CG)ACC-3＇和 def f2:5＇-TCT GT T(CTG)GA(TC)G AAC T(GT)CC(GC)G AG GA-3＇,委托大連寶生物公司合成。

1.2.2 誘導(dǎo)方法 第一組為羽化后3-5d的大劣按蚊雌蚊,吸食感染約氏瘧原蟲的小鼠血24 h后備用。第二組為同樣羽化的大劣按蚊雌蚊吸食感染約氏瘧原蟲的小鼠血后5 d的大劣按蚊雌蚊。第三組為吸食糖水的正常對(duì)照組。各組在正常羽化和攻擊感染后,均喂飼糖水飼養(yǎng)備用。

1.2.3 總RNA提取與RT-PCR 各取感染瘧原蟲后24 h的大劣按蚊蚊胃50只;各取感染瘧原蟲后5 d的大劣按蚊蚊胃50只;正常對(duì)照的大劣按蚊蚊胃50只置于1.5 mL的EP管中進(jìn)行組織勻漿,以T ripure液提取蚊胃組織總 RNA,氯仿-酚法分離RNA。將提取的總RNA與Oligo d(T)15 1μ L于恒溫水槽70℃變性10 min,冰上冷卻至0℃,分別加入 5 ×Buffer 4 μ L 、10 mM dNTP 1 μ L 、40 U/μ L RNase 抑制劑 0.5 μ L 、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L,以用滅RNA酶ddH2O補(bǔ)足體積至20 μ L。反應(yīng)條件為:恒溫水槽42℃2 h,最后在水浴內(nèi)以95℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min。

1.2.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng) PCR的反應(yīng)總體積為25 μ L,其中含 10 ×buffer 5 μ L,dNTP(2.0mmol/ml)4 μ L,模板 1 μ L,Mg2+(25 mmol/ml)1 μ L,上游引物和下游引物各 1.5 μ L,Taq 酶(5 U/μ L)0.5 μ L,后補(bǔ)滅菌雙蒸水至25 μ L。反應(yīng)程序設(shè)置如下:將反應(yīng)體系先在 94℃預(yù)變性 2 min,然后以94℃1 min,55℃1 min,72℃2 min,共 35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min終止反應(yīng)。取擴(kuò)增產(chǎn)物2 μ L,以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,在紫外熒光檢測儀下觀察結(jié)果。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的純化 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠、純化回收,按照上海博亞DNA凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6 TA克隆及測序 將目的片段與pMD18-T載體進(jìn)行16 h連接,具體操作按說明書進(jìn)行。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Cacl2法制備的DH 5α感受態(tài)細(xì)菌,涂布到含X-gal和IPTG的AMP選擇平板上進(jìn)行藍(lán)白篩選。在平板上隨機(jī)挑取幾個(gè)白斑送上海生工公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI的Blast查詢和Ex-PASy在線程序進(jìn)行序列相似性檢索和分析。對(duì)片段的蛋白結(jié)構(gòu)和功能、理化性質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 提取的總RNA的質(zhì)量鑒定

解剖分離大劣按蚊蚊胃,提取蚊胃總RNA,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,可見到較清晰的三條帶,即5 s、18 s、28 s,表明提取的大劣按蚊蚊胃總 RNA無降解,完整性和均一性較好,OD260/280≈1.832(圖1)。

2.2 蚊防御素基因的PCR擴(kuò)增

分別以感染瘧原蟲不同時(shí)間點(diǎn)的大劣按蚊蚊胃總RNA為模板,用 Defensin簡并引物進(jìn)行 RTPCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

2.3 防御素基因的序列測定及同源性分析

大劣按蚊的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3。瘧原蟲感染的大劣按蚊蚊胃cDNA以簡并引物擴(kuò)出一條約200 bp的目的片段,經(jīng)測序片段長度為189 bp。

2.4 大劣按蚊defensin基因序列的生物信息學(xué)分析

2.4.1 同源性比較 以簡并引物對(duì)瘧原蟲感染后蚊胃中擴(kuò)增出的大劣按蚊defensin基因核酸序列,登陸NCBI網(wǎng)站,經(jīng)Blast在線查詢,進(jìn)行同源性比較。該序列與岡比亞按蚊defensin有87%同源性,與白蚊伊蚊defensinsD有88%同源性,為大劣按蚊defensin基因。進(jìn)一步作ORF Finder分析,大劣按蚊defensin基因的最大閱讀框?yàn)?83 bp,起始密碼子為TGC,終止密碼子為GAA,編碼61個(gè)氨基酸。

2.4.2 推導(dǎo)氨基酸序列的分析 利用ProtParam軟件預(yù)測了該蛋白的理論分子量為6663.5,等電點(diǎn)pI為8.32,酸性氨基酸殘基總數(shù)為6,堿性氨基酸殘基總數(shù)為8,預(yù)測半衰期為5.5個(gè)小時(shí)。推測左側(cè)的亮氨酸端為其氨基酸序列的N-端。此蛋白包含了defensins的6個(gè)保守的半胱氨酸。經(jīng) Inter-ProSan程序分析,該基因氨基酸序列屬于Arthropod defensin家族。

2.4.3 編碼蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測 運(yùn)用ExPASy網(wǎng)站中SOPMA程序,對(duì)細(xì)菌感染后蚊胃中擴(kuò)出的防御素蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測。在此蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中,α螺旋占55.74%,其氨基酸殘基分別位于1、2、7～27 、35～ 45 位,氨基酸殘基 3、28 ～ 31 、47、48、53 、54、61位為β轉(zhuǎn)角,占16.39%,無規(guī)則螺旋占19.67%(圖4、5)。應(yīng)用DAS程序發(fā)現(xiàn)該基因編碼的氨基酸序列的跨膜方式可能是N-端在膜內(nèi),共有兩個(gè)跨膜區(qū)域,第一種為27～39位氨基酸殘基,由胞內(nèi)到胞外;第二種為第30～37位氨基酸殘基,由胞內(nèi)到胞外。

3 討論

防御素是小分子抗菌肽,屬于內(nèi)源性抗生素家族,它們?cè)谔禺惣?xì)胞中以前體分子形式存在,由N-端信號(hào)肽、前導(dǎo)肽和C-端成熟肽組成,經(jīng)過一系列加工后形成有生物活性的成熟防御素[7]。昆蟲defensin一般由28～54個(gè)氨基酸組成,含6個(gè)保守的半胱氨酸,并富含精氨酸,分子內(nèi)有3～4個(gè)二硫鍵,以cys1～4、cys2～5、cys3～6方式連接。它具有不需要抗體補(bǔ)體,吞噬細(xì)胞參與的新抗菌機(jī)制,其抗菌機(jī)理可能主要是使微生物細(xì)胞內(nèi)外膜通透性升高,細(xì)胞內(nèi) K+、Mg2+外泄,細(xì)胞外 Na+、Ca2+內(nèi)流,破壞微生物能量代謝,導(dǎo)致微生物死亡[8]。防御素的抗微生物活性對(duì)保守的氨基酸結(jié)構(gòu)敏感,有報(bào)道顯示N-端和C-端殘基是決定防御素抗菌能力的關(guān)鍵因素[9]。由于防御素?zé)o耐藥性問題的困擾,因此它有可能成為抗生素的替代品,有著廣闊的應(yīng)用前景。

昆蟲受病原體感染后,主要由昆蟲的脂肪體和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Defensin后釋放入血淋巴[10],它們?cè)隗w外存在抗細(xì)菌或真菌活性,被認(rèn)為是抵抗微生物感染的第一道防線。昆蟲defensin主要是抗細(xì)菌作用,但也有報(bào)道存在抗寄生蟲的活性[11]。經(jīng)瘧原蟲感染后蚊的中腸和唾液腺中也可被誘導(dǎo)產(chǎn)生defensin。但Lowenberger發(fā)現(xiàn),感染瘧原蟲并不能有效的誘導(dǎo)按蚊產(chǎn)生抗菌肽。體外實(shí)驗(yàn)表明合子和動(dòng)合子對(duì)防御素不敏感,而晚期的卵囊對(duì)其較敏感。細(xì)菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗菌肽可能主要作用于卵囊和子孢子期,抑制體內(nèi)瘧原蟲的發(fā)育。由于瘧原蟲易感的按蚊體內(nèi)同樣有防御素的轉(zhuǎn)錄,因此認(rèn)為瘧原蟲誘導(dǎo)按蚊產(chǎn)生的抗菌肽只能在一定程度上影響瘧原蟲的感染率,而不是按蚊阻斷瘧原蟲發(fā)育的主要免疫機(jī)制[12]。研究defensin產(chǎn)生的調(diào)節(jié)機(jī)制,有效誘導(dǎo)按蚊產(chǎn)生抗菌肽,從而阻斷按蚊體內(nèi)瘧原蟲的發(fā)育,可能是蚊媒防治的一種新方法。

本文以約氏瘧原蟲攻擊感染大劣按蚊雌蚊誘導(dǎo)表達(dá)defensin,分別提取不同時(shí)間點(diǎn)的蚊胃總RNA,利用RT-PCR擴(kuò)增以簡并引物對(duì)大劣按蚊的蚊胃進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果在蚊胃的cDNA中均成功克隆出defensin基因。瘧原蟲感染的大劣按蚊蚊胃cDNA擴(kuò)增出的defensin基因與岡比亞按蚊defensin有87%同源性,與白蚊伊蚊defensinsD有88%同源性,但片段較短(189 bp),可能是由于defensin并不是按蚊抗瘧原蟲感染的主要免疫機(jī)制,蚊對(duì)不同病原體的入侵所產(chǎn)生的defensin可能存在差異,尚有待進(jìn)一步研究。

我們成功克隆了大劣按蚊體內(nèi)defensins基因,并對(duì)其進(jìn)行了序列分析,預(yù)測其蛋白的結(jié)構(gòu)功能,分析其理化性質(zhì),為進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)載體,表達(dá)defensin蛋白,進(jìn)一步探討defensin的作用機(jī)制提供可能。也為闡明病原體與蟲媒間的相互作用機(jī)制,特別是病原體如何逃避蟲媒的防御體系,并在蟲媒體內(nèi)發(fā)育、以便傳播疾病等,對(duì)于制訂蟲媒病防治策略尤其重要。

[1]Fang W,Vega-Rodr íguez J,Ghosh AK et al.Development of transgenic fungi that kill human malaria parasites in mosquitoes[J].Science.2011,331(6020):1074-1077.

[2]Vizioli J,Richman AM,Uttenweiler Joseph S,et al.T he defensin peptide of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae:antimicrobiac activities and expression in adult mosquitoes[J].Insect Biochem M ol Biol,2001,31(3):241-248.

[3]Lowenberger C.Innate immune response of Aedes aegypti.Insect Biochemmistry and M olecular Bioligy[J].2001,31(3):219-229.

[4]Bulet P,Hetru C,Dimarcq JL,et al.Antimicrobial peptides in insects:structure and founction[J].Developmental and Comparative Immunology,1999,23:329-344.

[5]張錫林,陳繼德.醫(yī)學(xué)節(jié)肢動(dòng)物為抗感染免疫//李朝品.醫(yī)學(xué)節(jié)肢動(dòng)物學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:132-160.

[6]Eggleston P,Lu W,Zhao Y.Genomic organization and immune regulation of the defensin gene from the mosquito[J].Insect Mol Biol,2000,9(5):481-490.

[7]Bangham J,Jiggins F,Lemaitre B Insect Immunity:The Post-Genomic Era Immunity 2006,25(7):1-5.

[8]Ganz T.Defensins and host defence[J].Science,1999,286(5439):420-432.

[9]Kim CH,Park FW,Ha NC,et al Innate immune response in insects:recognition of bacterial peptidoglycan and amplification of its recognition signal[J].BM B Reports,2008,41(2):93-101.

[10]Blandin S,Moita LF,Kocher T,et al.Reverse genetics in the mosquito Anopheles gambiae:targeted disruption of the Defensin gene[J].EMBO,2002,3(9):852-856.

[11]Michael JL,Serap Aksoy,Elena Levashina.Immune responses and parasite transmission in blood-feeding insects[J].T rends in Parasitology,2004,20(9):433-439.

[12]Strand MR T he insect cellular immune response[J].Insect Science,2008,15(1):1-14.