大劣按蚊感染約氏瘧原蟲defensins基因的克隆及生物信息學分析

張錫林,王英,陳繼德,宋蓓

(第三軍醫大學基礎部病原生物學教研室 重慶,400038)

蚊蟲是人類感染疾病的重要傳播媒介,能傳播瘧疾、淋巴絲蟲病和多種蟲媒病毒病。昆蟲對各種病原體的入侵也會產生防御性免疫反應,產生的抗菌肽已被分離、鑒定[1],防御素(defensin)為其中的一大類,是廣泛存在于生物界具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽,它對G+細菌、分枝桿菌、真菌和某些有包膜的病毒均有殺滅作用,對除了大腸桿菌外的G-細菌幾乎無活性[2]。Defensins最早是從兔的肺泡巨噬細胞中分離出來,而昆蟲的defensins最早是從果蠅中發現的[3]。蚊的defensins基因首先從埃及伊蚊體內分離出來的,迄今為止已發現了40多種昆蟲defensins[4]。

大劣按蚊是東南亞地區和我國海南地區瘧疾的主要傳播媒介。按蚊的防御反應可通過激活黑化包被反應,殺死病原體。NO和抗菌肽的產生等機制可抑制體內瘧原蟲的發育。目前發現的瘧原蟲誘導按蚊產生的抗菌肽主要是防御素(defensins)[5],因此研究按蚊defensins的結構與功能,將有助于提高蟲媒病的防治水平。本文以大劣按蚊雌蚊為材料,分別以約氏瘧原蟲進行誘導,對其體內defensins進行克隆及序列生物信息學分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘧原蟲和按蚊 約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)BY265株為本實驗室保存的蟲株:每周用昆明株小鼠血傳 1次,每5周蚊傳1次。大劣按蚊(Anopheles dirus)海南株:由本實驗室在(24±0.5)℃、相對濕度(70±5)%的養蚊室飼養,供實驗使用。

1.1.2 菌株 大腸桿菌(Escherirchia coli DH 5α)由第三軍醫大學微生物教研室提供。

1.1.3 主要試劑 T ripure試劑購自羅氏公司;MMLV逆轉錄酶、DEPC為Promega公司產品;Oligo d(T)15 、TaqDNA 聚合酶 、dNTP、DNA Marker 和pMD18-T載體試劑盒購自Takara公司。DNA凝膠回收試劑盒,IPTG、X-gal購于上海博亞、氨芐青霉素,溴化乙錠為Sigma產品,其余試劑均為國產的分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設計及合成 根據已發表的岡比亞按蚊防御素基因序列[6],以及昆蟲防御素具有保守的半胱氨酸結構,設計合成一對簡并引物def f1:5＇-TGC ATT TCG(AG)CA(GC)AC(GA)CA(CG)ACC-3＇和 def f2:5＇-TCT GT T(CTG)GA(TC)G AAC T(GT)CC(GC)G AG GA-3＇,委托大連寶生物公司合成。

1.2.2 誘導方法 第一組為羽化后3-5d的大劣按蚊雌蚊,吸食感染約氏瘧原蟲的小鼠血24 h后備用。第二組為同樣羽化的大劣按蚊雌蚊吸食感染約氏瘧原蟲的小鼠血后5 d的大劣按蚊雌蚊。第三組為吸食糖水的正常對照組。各組在正常羽化和攻擊感染后,均喂飼糖水飼養備用。

1.2.3 總RNA提取與RT-PCR 各取感染瘧原蟲后24 h的大劣按蚊蚊胃50只;各取感染瘧原蟲后5 d的大劣按蚊蚊胃50只;正常對照的大劣按蚊蚊胃50只置于1.5 mL的EP管中進行組織勻漿,以T ripure液提取蚊胃組織總 RNA,氯仿-酚法分離RNA。將提取的總RNA與Oligo d(T)15 1μ L于恒溫水槽70℃變性10 min,冰上冷卻至0℃,分別加入 5 ×Buffer 4 μ L 、10 mM dNTP 1 μ L 、40 U/μ L RNase 抑制劑 0.5 μ L 、M-MLV 逆轉錄酶 1 μ L,以用滅RNA酶ddH2O補足體積至20 μ L。反應條件為:恒溫水槽42℃2 h,最后在水浴內以95℃滅活逆轉錄酶5 min。

1.2.4 PCR擴增反應 PCR的反應總體積為25 μ L,其中含 10 ×buffer 5 μ L,dNTP(2.0mmol/ml)4 μ L,模板 1 μ L,Mg2+(25 mmol/ml)1 μ L,上游引物和下游引物各 1.5 μ L,Taq 酶(5 U/μ L)0.5 μ L,后補滅菌雙蒸水至25 μ L。反應程序設置如下:將反應體系先在 94℃預變性 2 min,然后以94℃1 min,55℃1 min,72℃2 min,共 35個循環,最后72℃延伸10 min終止反應。取擴增產物2 μ L,以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,在紫外熒光檢測儀下觀察結果。

1.2.5 PCR產物的純化 對PCR產物進行切膠、純化回收,按照上海博亞DNA凝膠回收試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 TA克隆及測序 將目的片段與pMD18-T載體進行16 h連接,具體操作按說明書進行。重組質粒轉入Cacl2法制備的DH 5α感受態細菌,涂布到含X-gal和IPTG的AMP選擇平板上進行藍白篩選。在平板上隨機挑取幾個白斑送上海生工公司進行測序。測序結果經NCBI的Blast查詢和Ex-PASy在線程序進行序列相似性檢索和分析。對片段的蛋白結構和功能、理化性質進行生物信息學預測。

2 結果

2.1 提取的總RNA的質量鑒定

解剖分離大劣按蚊蚊胃,提取蚊胃總RNA,經1.0%瓊脂糖凝膠電泳,可見到較清晰的三條帶,即5 s、18 s、28 s,表明提取的大劣按蚊蚊胃總 RNA無降解,完整性和均一性較好,OD260/280≈1.832(圖1)。

2.2 蚊防御素基因的PCR擴增

分別以感染瘧原蟲不同時間點的大劣按蚊蚊胃總RNA為模板,用 Defensin簡并引物進行 RTPCR擴增,PCR擴增結果見圖2。

2.3 防御素基因的序列測定及同源性分析

大劣按蚊的PCR擴增結果見圖3。瘧原蟲感染的大劣按蚊蚊胃cDNA以簡并引物擴出一條約200 bp的目的片段,經測序片段長度為189 bp。

2.4 大劣按蚊defensin基因序列的生物信息學分析

2.4.1 同源性比較 以簡并引物對瘧原蟲感染后蚊胃中擴增出的大劣按蚊defensin基因核酸序列,登陸NCBI網站,經Blast在線查詢,進行同源性比較。該序列與岡比亞按蚊defensin有87%同源性,與白蚊伊蚊defensinsD有88%同源性,為大劣按蚊defensin基因。進一步作ORF Finder分析,大劣按蚊defensin基因的最大閱讀框為183 bp,起始密碼子為TGC,終止密碼子為GAA,編碼61個氨基酸。

2.4.2 推導氨基酸序列的分析 利用ProtParam軟件預測了該蛋白的理論分子量為6663.5,等電點pI為8.32,酸性氨基酸殘基總數為6,堿性氨基酸殘基總數為8,預測半衰期為5.5個小時。推測左側的亮氨酸端為其氨基酸序列的N-端。此蛋白包含了defensins的6個保守的半胱氨酸。經 Inter-ProSan程序分析,該基因氨基酸序列屬于Arthropod defensin家族。

2.4.3 編碼蛋白結構的預測 運用ExPASy網站中SOPMA程序,對細菌感染后蚊胃中擴出的防御素蛋白進行結構預測。在此蛋白的二級結構中,α螺旋占55.74%,其氨基酸殘基分別位于1、2、7～27 、35～ 45 位,氨基酸殘基 3、28 ～ 31 、47、48、53 、54、61位為β轉角,占16.39%,無規則螺旋占19.67%(圖4、5)。應用DAS程序發現該基因編碼的氨基酸序列的跨膜方式可能是N-端在膜內,共有兩個跨膜區域,第一種為27～39位氨基酸殘基,由胞內到胞外;第二種為第30～37位氨基酸殘基,由胞內到胞外。

3 討論

防御素是小分子抗菌肽,屬于內源性抗生素家族,它們在特異細胞中以前體分子形式存在,由N-端信號肽、前導肽和C-端成熟肽組成,經過一系列加工后形成有生物活性的成熟防御素[7]。昆蟲defensin一般由28～54個氨基酸組成,含6個保守的半胱氨酸,并富含精氨酸,分子內有3～4個二硫鍵,以cys1～4、cys2～5、cys3～6方式連接。它具有不需要抗體補體,吞噬細胞參與的新抗菌機制,其抗菌機理可能主要是使微生物細胞內外膜通透性升高,細胞內 K+、Mg2+外泄,細胞外 Na+、Ca2+內流,破壞微生物能量代謝,導致微生物死亡[8]。防御素的抗微生物活性對保守的氨基酸結構敏感,有報道顯示N-端和C-端殘基是決定防御素抗菌能力的關鍵因素[9]。由于防御素無耐藥性問題的困擾,因此它有可能成為抗生素的替代品,有著廣闊的應用前景。

昆蟲受病原體感染后,主要由昆蟲的脂肪體和淋巴細胞產生Defensin后釋放入血淋巴[10],它們在體外存在抗細菌或真菌活性,被認為是抵抗微生物感染的第一道防線。昆蟲defensin主要是抗細菌作用,但也有報道存在抗寄生蟲的活性[11]。經瘧原蟲感染后蚊的中腸和唾液腺中也可被誘導產生defensin。但Lowenberger發現,感染瘧原蟲并不能有效的誘導按蚊產生抗菌肽。體外實驗表明合子和動合子對防御素不敏感,而晚期的卵囊對其較敏感。細菌誘導產生的抗菌肽可能主要作用于卵囊和子孢子期,抑制體內瘧原蟲的發育。由于瘧原蟲易感的按蚊體內同樣有防御素的轉錄,因此認為瘧原蟲誘導按蚊產生的抗菌肽只能在一定程度上影響瘧原蟲的感染率,而不是按蚊阻斷瘧原蟲發育的主要免疫機制[12]。研究defensin產生的調節機制,有效誘導按蚊產生抗菌肽,從而阻斷按蚊體內瘧原蟲的發育,可能是蚊媒防治的一種新方法。

本文以約氏瘧原蟲攻擊感染大劣按蚊雌蚊誘導表達defensin,分別提取不同時間點的蚊胃總RNA,利用RT-PCR擴增以簡并引物對大劣按蚊的蚊胃進行擴增,結果在蚊胃的cDNA中均成功克隆出defensin基因。瘧原蟲感染的大劣按蚊蚊胃cDNA擴增出的defensin基因與岡比亞按蚊defensin有87%同源性,與白蚊伊蚊defensinsD有88%同源性,但片段較短(189 bp),可能是由于defensin并不是按蚊抗瘧原蟲感染的主要免疫機制,蚊對不同病原體的入侵所產生的defensin可能存在差異,尚有待進一步研究。

我們成功克隆了大劣按蚊體內defensins基因,并對其進行了序列分析,預測其蛋白的結構功能,分析其理化性質,為進一步構建表達載體,表達defensin蛋白,進一步探討defensin的作用機制提供可能。也為闡明病原體與蟲媒間的相互作用機制,特別是病原體如何逃避蟲媒的防御體系,并在蟲媒體內發育、以便傳播疾病等,對于制訂蟲媒病防治策略尤其重要。

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