姜黃素對膿毒癥大鼠器官的保護作用

李晶菁，沈雁波

（南通大學附屬醫院急診科，江蘇 南通 226001）

膿毒癥是各種嚴重創傷、燒傷、缺氧、再灌注損傷及外科大手術常見并發癥［1］。據統計，美國每年約有75萬人發生膿毒癥休克，病死率達50%以上［2］。膿毒癥是由感染因素引起的全身炎癥反應綜合征（SIRS），是一個涉及大量局部和全身性反應的復雜病理過程，其病程較兇險，一旦演變為膿毒性休克或多器官功能障礙綜合征（MODS）則治療困難，預后惡劣［3］。急性肝損傷作為膿毒癥的常見并發癥，對于判斷膿毒癥病情及預后具有重要意義。目前尚缺乏特效藥物治療膿毒癥，這也是國內外的研究熱點。姜黃素（curcumin）是從姜科植物的根莖中提取的一種天然化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑菌等多種藥理活性。姜黃素是否在膿毒癥急性肝損傷中有保護作用及其機制如何，相關報道尚不多見。本實驗通過姜黃素干預膿毒癥大鼠并測定肝功能、抗氧化能力等表達變化，探討姜黃素膿毒癥急性肝損傷保護作用，以期為臨床防治膿毒癥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立

采用盲腸結扎穿孔法（CLP法）制模，CLP模型的標準步驟主要參考Rittirsch等［4］的報道。

72只健康雄性SD大鼠，清潔級，體重（260±20）g，由南通大學實驗動物中心提供。隨機平分為3組，即對照組、實驗組、干預組，每組各24只，3組按術后6、12、24、48h時間點分成不同亞組。實驗組、干預組在以3%的戊巴比妥鈉（45mg／kg）腹腔注入麻醉后，采用CLP法建立膿毒癥模型，對照組為假手術組，以同樣方法開腹，但盲腸不結扎也不穿孔。干預組在CLP術后1h按100mg／kg劑量腹腔內注射姜黃素，實驗組、假手術組予以等量生理鹽水。

1.2 標本采集

分別于制模后6、12、24、48將72只大鼠麻醉（方法同前），打開胸腹腔，心臟采血，分離肝臟組織，一部分液氮凍存，檢測總抗氧化能力（T－AOC）、谷胱甘肽過氧化酶（GPx）；另外一部分10%中性甲醛固定，石蠟包埋、切片，行蘇木精－伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察組織學改變。

1.3 組織勻漿制備

制備10%組織勻漿：取組織塊0.2～1g在冰冷生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，稱重，放入小燒杯內，移取組織塊9倍的0.86%的冰冷生理鹽水2／3于燒杯內，剪碎組織塊，組織倒入勻漿管中，再將剩余的1／3冰冷生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊一起倒入勻漿管，充分勻漿6～8min。將制備好的勻漿用離心機2000r／min離心15min，離心半徑13.5cm，留上清去沉淀，－80℃冰箱保存。

1.4 各項指標檢測

1.4.1 丙氨酸氨基轉移酶（ALT）采血、分離血清，全自動生化儀測定ALT。

1.4.2 T－AOC 用南京建成生物工程研究所提供T－AOC測定盒，采用化學比色法檢測T－AOC。

1.4.3 GPx 用南京建成生物工程研究所提供GPx測定盒，采用化學比色法檢測GPx。

1.5 統計學方法

所有計量數據采用均數±標準差表示，數據分析的統計學方法為具有一個重復測量因素的兩因素方差分析，分析軟件采用STATA V10.0軟件包，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時相ALT比較

實驗組ALT隨時間的變化而逐漸增高，實驗組與對照組ALT在各個時間段的差異有統計學意義（χ2＝3981.54，P＝0.0000）。兩者在6h比較，Z＝7.18，P＝0.000；兩者在12h比較，Z＝34.27，P＝0.000；兩者在24h比較，Z＝11.96，P＝0.000；兩者在48h比較，Z＝3.08，P＝0.002。干預組ALT隨時間亦有增高趨勢，但增高幅度較實驗組小，干預組與實驗組ALT在各個時間段的差異有統計學意義（χ2＝2430.56，P＝0.000）。兩 者 在 6h 比 較，Z＝－4.85，P＝0.000；兩者在12h比較，Z＝－20.15，P＝0.000；兩者在24h比較，Z＝－4.63，P＝0.000；兩者在48h比較，Z＝0.44，P＝0.660。干預組與對照組ALT在各個時間段的差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 各組大鼠不同時相ALT的比較（mmol／l，±s）Tab.1 The comparison of ALT of the rats in different time points（mmol／l，±s）

表1 各組大鼠不同時相ALT的比較（mmol／l，±s）Tab.1 The comparison of ALT of the rats in different time points（mmol／l，±s）

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2.2 各組大鼠不同時相T－AOC比較

實驗組T－AOC先升高后降低，其趨勢與干預組相仿，但T－AOC較干預組及對照組低。實驗組與對照組T－AOC在各個時間段的差異有統計學意義（χ2＝1919.07，P＝0.0000）。兩者在6h比較，Z＝－26.84，P＝0.000；兩者在12h比較，Z＝0.77，P＝0.438；兩者在24h比較，Z＝4.07，P＝0.000；兩者在48h比較，Z＝9.75，P＝0.000。干預組與實驗組T－AOC在各個時間段的差異有統計學意義（χ2＝683.89，P＝0.0000）。兩者在6h比較，Z＝8.13，P＝0.000；兩者在12h比較，Z＝－0.478，P＝0.000；兩者在24h比較，Z＝－2.30，P＝0.021；兩者在48h比較，Z＝0.66，P＝0.508。詳見表2。

表2 各組大鼠不同時相T－AOC的比較（U／ml，±s）Tab.2 The comparison of T－AOC of the rats in different time points（U／ml，±s）

表2 各組大鼠不同時相T－AOC的比較（U／ml，±s）Tab.2 The comparison of T－AOC of the rats in different time points（U／ml，±s）

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2.3 各組大鼠不同時相GPx比較

實驗組隨時間的變化GPx逐漸升高，而干預組先升高后下降，實驗組GPx較干預及對照組低。實驗組與對照組GPx在各個時間段的差異有統計學意義（χ2＝2119.12，P＝0.0000）。兩者在6h比較，Z＝－29.88，P＝0.000；兩者在12 h比較，Z＝10.93，P＝0.000；兩者在24h比較，Z＝7.61，P＝0.000；兩者在48h比較，Z＝4.08，P＝0.000。干預組與實驗組GPx在各個時間段的差異有統計學意義（χ2＝1014.63，P＝0.0000）。兩者在6h比較，Z＝6.30，P＝0.000；兩者在12h比較，Z＝－5.36，P＝0.000；兩者在24h比較，Z＝6.13，P＝0.000；兩者在48h比較，Z＝2.04，P＝0.041。詳見表3。

表3 各組大鼠不同時相GPx的比較（活力單位，±s）Tab.3 The comparison of GPx of the rats in different time points（active unite，±s）

表3 各組大鼠不同時相GPx的比較（活力單位，±s）Tab.3 The comparison of GPx of the rats in different time points（active unite，±s）

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2.4 肝臟病理改變

光學顯微鏡下，對照組各時間點無明顯變化，實驗組6h鏡下見肝細胞水腫、肝血竇充血、炎癥細胞浸潤，6h后隨時間的延長，呈進行性加重，肝組織大量炎癥細胞浸潤，細胞變性，結構紊亂，干預組內組織水腫、充血、炎細胞浸潤及組織結構紊亂等表現較實驗組減輕。取各組12h點病理切片進行比較（圖1～3）。

圖1 對照組12h肝臟病理切片。光鏡下見肝組織結構基本正常，肝細胞排列整齊，肝竇內無明顯炎性細胞浸潤。HE染色，×100Fig.1 The liver tissue section of control group 12hours afrer mold.The basic structure of liver tissue is normal，liver cells is arranged in neat rows and sinusoidal has no obvious infiltration of inflammatory cells under the light microscope.HE staining，×100

3 討論

圖2 實驗組12h肝臟病理切片。光鏡下見肝細胞腫脹、肝竇內充血、炎癥細胞浸潤。HE染色，×100Fig.2 The liver tissue section of experimental group 12hours ofter mold.The liver cells is swelling，sinusoidal has obvious infiltration of inflammatory cells and blood cells under the light microscope.HE staining，×100

圖3 干預組12h肝臟病理切片。光鏡下見肝細胞腫脹、肝竇內充血、炎癥細胞浸潤，但較實驗組輕。HE染色，×100Fig.3 The liver tissue section of intervention group 12hours after mold.The liver cells are swelling，sinusoidal has obvious infiltration of inflammatory cells and blood cells under the light microscope but the changs are better than experimental group.HE staining，×100

CLP法是膿毒癥研究動物模型的“金標準”，CLP模型不僅易于標準化，還可以引入多種不同變量，因此在實驗室被廣泛應用，其原理是腹腔內感染形成腹膜炎，多重病原體感染導致SIRS、膿毒癥、膿毒癥休克甚至死亡。膿毒癥是由感染因素引起的SIRS，是各種嚴重創傷、燒傷、缺氧、再灌注損傷及外科大手術常見并發癥，也是引起膿毒性休克和多臟器功能障礙綜合癥的重要原因，它多伴有顯著的氧化應激并與器官損傷和死亡率相關［5，6］。氧化應激是由氧化性化學物質的釋放超過機體抗氧化系統防御能力所引起的一種狀態，T－AOC和GPx反映機體抗氧化能力；T－AOC的高低可以反映機體清除氧自由基的能力；GPx是機體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化物分解的酶，它特異的催化還原性谷胱甘肽（GSH）對過氧化物的還原反應，可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。近年的研究表明氧化應激能夠損傷肝細胞，是一種重要病理生理過程，因此通過加強機體抗炎抗氧化作用改善膿毒癥預后，不失為膿毒癥治療的一條有效途徑［7，8］。姜黃素是從姜科植物的根莖中提取的一種天然化合物，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、抑菌等多種藥理活性。姜黃素是一個由兩個酚羥基，兩個不飽和酮雙鍵，一個β－二酮和一個中性活性亞甲基組成的對稱分子結構，其中酚羥基和β－二酮是其抗氧化活性部位［9］。目前研究發現姜黃素可通過提供質子直接清除氧自由基，還可抑制活性氧族／活 性 氮 族 （reactive oxygen species／reactive nitrogene species，ROS／RNS）的產生，誘導抗氧化酶表達或增強其活性［10］。Sompamit等研究表明，姜黃素可通過降低內毒素血癥小鼠心血管組織中的氧化應激，改善血管功能并保持血流動力學穩定性［11］。亦有報道姜黃素能增加機體血液和組織中各種抗氧化物酶的活性如GPx、過氧化氫酶等的活性，總抗氧化能力提高，從而清除自由基，減輕氧化應激反應［12］。目前膿毒癥居高不下，且缺乏有效的治療措施，特別是中成藥的治療，相關報道尚不多見，本實驗旨在探討姜黃素通過抗炎、抗氧化作用對膿毒癥急性肝損傷的保護作用，從而為其治療膿毒癥提供依據，為臨床提供新方法。本實驗中隨著肝功能的惡化，T－AOC、GPx的變化，在姜黃素的干預下機體的抗氧化能力明顯提高，預后改善，從而證明姜黃素在膿毒癥中具有提高機體抗氧化能力，對膿毒癥具有治療作用。實驗還表明通過提高機體的抗氧化能力，可以增加膿毒癥的療效，從而為居高不下的膿毒癥提供新的治療措施，改善預后。但由于實驗中觀察樣本量小，觀察指標設定較少，且姜黃素的用藥劑量主要參考相關文獻，而對于最佳治療劑量未進一步確定，此外不同給藥時間、單次給藥與多次或連續給藥方式的治療作用有無差別尚需進一步研究，還有待進一步實驗的論證及實踐的檢驗。針對膿毒癥的單一治療都沒取得預期的效果，而中西醫結合治療對于提高膿毒癥治療效果具有重要意義，將為攻克膿毒癥防治難題開啟新的途徑。

［1］盛志勇，姚詠明.近年來國內有關創傷后膿毒癥研究的一些進展.中國工程院醫藥衛生工程學部2002年醫學科學前沿“炎癥與修復”高級學術研討會、第三屆全國創傷修復（愈合）與組織再生學術交流會，廣州，2002.1－8.

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［3］姚詠明，盛志勇.膿毒癥研究的若干新動態［J］.中國危重病急救學，2000，12：323－325.

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