酶聯免疫吸附法、甲苯胺紅不加熱血清試驗、明膠顆粒凝集法檢測梅毒血清抗體比較

王嫻，黃瀟葦，曾著黎，牟皎，程莉惠

（1.成都市第三人民醫院檢驗科，四川 成都 610031；2.川北醫學院醫學檢驗系2006級，四川 南充 637000）

梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）不能在體外 培養，只能在活體內繁殖，而且主要對兔睪丸和眼前房敏感。因此，檢測病原體只能直接在病灶中采集標本后立即做暗視野顯微鏡觀察（R－F），因為成本、操作復雜和檢測時效等原因，除研究外，一般不做R－F和兔睪丸感染試驗（RIT）。根據TP感染機體后特殊的免疫反應規律，梅毒檢測方法主要是針對非特異性抗體和特異性抗體的血清學檢測，如梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗（toluidine red unheated serum test，TRUST）、梅毒螺旋體抗體診斷試劑（凝集法）（treponema pallidum particle agglutination assay，TP－PA）、梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒（雙抗原夾心酶聯免疫吸附法）（treponema pallidum enzyme linked immunosorbent assay，TP－ELISA）。現在有少數實驗室在用PCR技術檢測TP－DNA和采用梅毒抗體蛋白印跡法（Western－blot）檢測TP特征蛋白條帶，但是一般都是做研究［1］。我們采用TP－ELISA和TRUST兩種方法同時對臨床14 307例血清標本進行初篩，對TP－ELISA與TRUST結果不符的標本及ELISA法S／CO值在0.70～0.99的標本用TP－PA檢測，并將結果進行比較分析，以期為臨床梅毒檢測方法的選擇提供參考。現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 研究對象

14 307例血清標本來自2010年9月～2011年5月在我院申請梅毒血清檢測的臨床各科室住院及門診所有標本。

1.2 標本收集

住院患者入院當天或者第2天，于清晨空腹抽取靜脈血3mL，置于未加抗凝劑的采血管中，3000r／min下離心5min，分離血清待測。門診患者申請梅毒血清檢測后于清晨空腹抽取靜脈血3mL，標本處理程序同前。

1.3 儀器與試劑

瑞士澳斯邦AT機（AT Plus2 2757）全自動加樣儀；瑞士FAME全自動酶免疫分析儀。TP－ELISA診斷試劑盒（北京萬泰生物公司）；TRUST試劑（上海榮盛生物藥業有公司）；TP－PA診斷試劑（日本富士銳必歐株式會社）。質控品：批號：200907003；有效期：201107（北京康徹思坦生物有限公司）。

1.4 檢測方法

14 307份血液標本中同時用TP－ELISA法和TRUST進行梅毒初篩，對TP－ELISA與TRUST結果不符的標本及TP－ELISA法S／CO值在0.70～0.99的標本用 TP－PA 檢測［2］。所有檢測方法操作和實驗條件與試劑說明書保持一致，質控品用ELISA法測定均在控。

1.5 統計學方法

分別統計TP－ELISA和TRUST的陽性檢出率、TRUST的漏檢率及TP－ELISA的假陽性率。對TP－ELISA初篩S／CO值在0.70～0.99的標本統計 TP－ELISA的假陰性率。

2 結果

14 307例血清標本篩查出203例TP－ELISA陽性。203例TP－ELISA中115例TRUST陽性，88例TRUST陰性。TP－ELISA陽性檢出率為1.42%（203／14 307），TRUST 的陽性檢出率為0.80%（115／14 307），TRUST 的漏檢率為43.35%（88／203）（表1）。TP－ELISA 陽性 TRUST 陰性的標本88例，進一步做TP－PA，其中1例陰性，TP－ELISA的假陽性率為0.49%（1／203）。該例患者87歲，為骨科收治患者（臨床診斷為頸椎病，基礎疾病有糖尿病、高血壓）；其兩次不同時間抽血檢測結果均為TP－ELISA陽性，S／CO值分別為5.361和3.109，但 TRUST和 TP－PA均陰性。

表1 TP－ELISA與TRUST初篩檢測結果Tab.1 Results of TP－ELISA and TRUST

對 TP－ELISA 初 篩 S／CO 值 在 0.70～0.99 同 時TRUST均為陰性的23例標本，做TP－PA檢測，檢出陽性2例，陰性21例，TP－ELISA的假陰性率為8.70%（2／23）。

3 討論

機體感染梅毒螺旋體后可產生特異性抗梅毒螺旋體抗體（TP－Ab）和非特異性抗類脂質抗體。梅毒特異性抗體出現早、消失遲，即便經過正規抗梅毒治療，仍可檢出其特異性抗體，甚至可終生檢出。非特異性抗體出現遲、消失早，在一期梅毒早期、三期梅毒、晚期潛伏梅毒及治療后梅毒出現假陰性。目前用于檢測這兩種抗體的方法有性病研究實驗室試驗（VDRL）、不加熱血清反應素試驗（USR）、快速血漿反應素 試 驗 （RPR）、TRUST、TP－ELISA、梅 毒 膠 體 金 法（SYP）、熒光密螺旋體抗體吸收試驗（FTA－ABS）、梅毒螺旋體血凝試驗（TP－HA）、TP－PA、梅毒螺旋體制動試驗（TPI）等10種，但臨床檢驗室較常用的是TP－ELISA、TRUST、RPR及TP－PA［2］。由于檢驗方法較多，各種方法又有其特殊的臨床應用價值，如何更合理地選用這些方法應用于臨床梅毒檢測是臨床實驗室需要解決的問題。為制定出適合本院的梅毒檢測方案，結合本組所得數據，我們對本院使用的3種梅毒血清學檢測方法進行了綜合評估。

TP－ELISA的原理為利用基因重組工程合成抗原，檢測血清中的梅毒特異性抗體，在梅毒的潛伏期即產生，約在感染后2周，對梅毒的早期輔助診斷較好［3］。ELISA試劑成本低，操作方便，可使用全自動或半自動酶標儀，原始數據易于保存，是大批量標本梅毒篩查的理想方法。但是該法檢測的是梅毒IgM和IgG的混合抗體，梅毒IgG抗體治愈后相當長的時間內仍然存在較高的陽性率，甚至終身陽性，因此，TPELISA陽性只說明正在感染或曾經感染過，不能判斷梅毒疾病活動與否，所以不能作為療效監測手段，故對梅毒的診斷必須結合臨床表現，否則可能導致臨床誤診，并增加患者的心理負擔。本組結果中TP－ELISA的陽性檢出率為1.42%，與易海清等［4］報道的1.6%相似；TP－ELISA 與 TP－PA 符合率較高，達98.86%（87／88），但仍然存在一定的假陽性率與假陰性率。分析假陽性的原因，可能與血清中纖維蛋白有關，研究表明自身免疫病、瘧疾、新近免疫接種、皮膚病、心血管病、結核、麻風、靜脈注射毒品、病毒感染、熱性病可導致TP－ELISA試驗假陽性［5］，而一些患者的基礎疾病可能使機體釋放誘導產生抗類脂抗體或抗TP抗體的交叉抗原引起假陽性［6］，此外，目前TP－ELISA試劑盒均未配置吸收稀釋劑，待測血清均未用吸收劑吸除與非梅毒螺旋體交叉反應的抗體［7］；假陰性的原因則可能與ELISA所用包被抗原和標記抗原的成分的純度、效價和抗原的種類有關，研究表明單一基因重組抗原比多種基因重組抗原聯合用于ELISA檢測梅毒的靈敏度低［8，9］。綜合考慮，我們認為，TP－ELISA 適合血站獻血者篩查、醫院大批量體檢和大、中型醫院實驗室對梅毒感染的早期檢查，但其檢查結果應結合TRUST以觀察療效和TP－PA以排除假陽性、假陰性。

TRUST法的檢測原理是采用牛心磷脂作為抗原檢測非特異性抗體，在一期梅毒早期，三期梅毒，晚期潛伏梅毒及治療后梅毒可出現假陰性［10］。本次實驗TRUST的陽性檢出率為0.80%（115／14 307），漏檢率43.35%（88／203），與栗艷等［11］報道的45.30%相似，表明TRUST法存在假陰性。據報道，TRUST在一、二期梅毒的檢出率高達96%～100%［12］，但在一期梅毒潛伏期及晚期梅毒的檢出率較低，僅58%～85%［13，14］，同時受一些其他因素干擾，如瘧疾、類風濕性節炎、SLE等疾病，TRUST法可出現假陽性［5］。這些數據表明，TRUST法容易造成漏檢，特別是對早期梅毒的輔助診斷能力差，因此不適合用于早期梅毒的輔助診斷；但該方法操作簡便，試劑價格便宜，反應快，不需要特殊儀器設備，方便測定抗體滴度，其滴度變化與梅毒的治療情況呈正相關，適合用于療效觀察、隨訪和復發的輔助診斷以及基層醫院應用，在臨床發揮著不可替代的作用［15］。

TP－PA的原理為利用梅毒螺旋體毒株制成Ag，檢測特異性抗體。其靈敏度與TP－ELISA接近，但其特異性比TPELISA高，能夠排除TP－ELISA的假陽性和假陰性，是臨床常用的梅毒確診試驗。TP－PA試劑穩定、操作簡單、不需要專門儀器、結果可靠，與ELISA之間的一致性高，但試劑較貴，檢測時需將標本作系列稀釋，不利于大批量標本檢測，且以肉眼判斷結果，原始數據無法保存。該法檢測的同樣是梅毒IgM和IgG的混合抗體，存在著與TP－ELISA類似問題，因此適合用于前兩種方法測定陽性后的確診試驗，以及排除TP－ELISA檢測中假陰性者。

鑒于 RP－ELISA、TRUST、TP－PA 三種方法各有優缺點，我們認為可制定梅毒血清學檢測流程，以利于最大程度提高檢出率，同時降低成本和漏檢率。流程如下：（1）對臨床住院及門診申請做TP檢查的標本同時做TP－ELISA和TRUST初篩，對TP－ELISA與TRUST結果相符的標本則直接出TP－ELISA與TRUST結果報告。對TP－ELISA與TRUST結果不符的標本進一步做TP－PA檢測；（2）對于TP－ELISA法初篩S／CO值在0.70～0.99之間同時TRUST為陰性的血清標本，進行TP－PA復檢，以排除假陰性。

但本組觀察也存在較多不足與缺陷：（1）本組觀察是對具體檢測工作的總結，并未嚴格控制實驗條件如溫度、濕度等，存在不嚴謹之處。（2）進行大樣本量的比較評價時，先采用TP－ELISA法及TRUST初篩，然后對初篩結果不符的標本才進行TP－PA的檢測，沒有做到同步盲法，這種情況不能真實反映方法對人群整體檢測能力，評估欠全面。（3）梅毒檢測公認金標準為熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA－ABS），而本次試驗是以TP－PA為確證試驗，對可疑或不確定的標本沒有進一步確認。（4）循環比較，即用被評價方法TPELISA本身作為標準與TRUST及TP－PA比較，無法確定實驗方法敏感性、特異性、Youden′s指數以及方法間的一致性。（5）鑒于TP－ELISA法初篩S／CO值在0.70～0.99之間同時TRUST為陰性的血清標本量僅為23例，因此關于TPELISA的假陰性率還有待做大批量統計進一步進行論證。

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