人乳頭瘤病毒DNA聯合液基薄層細胞學檢測在宮頸癌篩查診斷中的研究

楊忠明，丁顯平，龐博，周小燕，周麗，謝芳賢

（1.四川大學生命科學學院生物資源與生態環境教育部重點實驗室遺傳醫學研究所，四川 成都 610064；

2.四川省彭州市中醫醫院腫瘤科，四川 彭州 611930；3.四川省彭州市中醫醫院分子生物學實驗室，四川 彭州 611930；

4.四川省彭州市中醫醫院病理科，四川 彭州 611930；5.四川省彭州市中醫醫院婦科，四川 彭州 611930）

許多研究表明，宮頸癌的發病與人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）密切相關，99%以上的宮頸癌有HPV感染，HPV是宮頸癌的主要致病因子［1］，近年這些發現已引起了學者們的高度重視。統計顯示，我國每年宮頸癌新發病例13.5萬，約占世界的1／4，宮頸癌與HPV感染有明確關系［2］。目前，許多國家已經逐步展開了HPV感染與宮頸癌的篩查工作。文獻表明HPV各個亞型的感染存在地區分布差異。我國地廣人多，雖然也有部分地區報道了HPV亞型分布情況，但覆蓋范圍非常有限。大量研究表明宮頸癌是一個可以預防的疾病，其潛伏期長，早期發現及時治療，預后較好，5年生存率高達90%以上，因此其篩查和預防具有十分重要的意義。為探討本地區婦女HPV感染及HPV亞型的分布狀況，我們采用HPV檢測和薄層液基細胞學技術（thin prep liquid－based cytology test，TCT），結合陰道鏡指示下定位活檢，發現其在宮頸癌及癌前病變的早期診斷方面具有重要的意義，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

進行HPV篩查婦女1080例，均為2010年1月～2011年11月在本院門診檢查的、有3年以上性生活史、早婚早育、多個性伴侶、多產、有慢性宮頸病變和宮頸癌家族史之一的婦女，年齡25～71歲，取材要求為月經干凈期，48h內無性生活史，白帶檢查清潔度正常。

1.2 標本采集

采用專用宮頸刷收集宮頸分泌物中的脫落細胞，將毛刷頭置于保存液中用于HPV基因分型檢測；先以窺陰器暴露宮頸，用棉拭子將宮頸口分泌物擦去，取出宮頸刷置于宮頸口，單方向旋轉4～5次，然后將宮頸刷頭部放入洗脫管中，沿刷柄折痕處將宮頸刷柄折斷，旋緊洗脫管蓋，做好樣本標識，將洗脫管直立放置。陰道鏡指示下宮頸活檢：窺陰器擴開陰道暴露宮頸，拭凈宮頸表面分泌物，然后涂碘，在病變最嚴重的部位多點取材活檢。

1.3 試劑和儀器

HPV基因分型檢測試劑盒由深圳亞能生物技術有限公司提供，能同時檢測23種亞型，包括18種高危亞型：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4；5種低危亞型：HPV6、11、42、43、44。基因擴增儀為上海宏石公司適時熒光定量SL型PCR擴增儀，雜交用江蘇興化市分析儀器廠FYY－3型分子雜交儀；此外還有巴氏染色液和顯微鏡等。

1.4 方法

1.4.1 HPV基因分型檢測 常規提取宮頸分泌物HPVDNA、PCR擴增、雜交、洗膜、顯色、膜條掃描與保存、讀取結果，具體操作按照說明書進行；組織病理學診斷常規制片、巴氏染色、鏡檢分析。

1.4.2 液基細胞學診斷方法 采用2001年TBS分類法［3］。①正常或炎癥（within normal limits，WNL）；②未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASC－US）；③低級別鱗狀上皮病變（low－grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）；④高級別鱗狀上皮病變（high－grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）；⑤鱗狀上皮癌（squamous cell carcinoma，SCC）；⑥不明意義的不典型腺細胞（atypical glandular cell of undetermined significance， AGC－US ）； ⑦ 腺 癌（adenocarcinoma，AC）。

1.4.3 宮頸活檢病理檢查 采用陰道鏡指引下多點活檢送病理科檢查。按TBS方案統一組織學和細胞學診斷術語，LSIL宮頸上皮內瘤變I級（grade 1cervical intraepithelial neoplasia，CINⅠ）和宮頸HPV感染，HSIL含CINⅡ及其以上病變（CINⅢ）。

2 結果

1080例標本中HPV陽性315例，HPV總感染率為29.17%。共檢測出20種基因亞型，包括16種高危型基因HPV16、18、31、33、35、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83和4種低危型基因 HPV6、11、42、43基因型別（見表1，2）。高危型基因HPV感染共計331例，結果主要包括HPV16感染134例（12.41%），HPV58感染86例（7.96%），HPV52感染28例（2.59%），HPV33感染27例（2.50%）等；高危基因型別中HPV16、HPV58檢出率明顯高于其他基因亞型，并且HPV52、33檢出率也較高（見表1）。低危基因型HPV感染共計61例，結果主要包括 HPV6感染11例（1.01%）、HPV11感染16例（1.48%），HPV43感染29例（2.69%）等；HPV低危型基因陽性病例較少，明顯低于高危型基因陽性病例；HPV43感染病例較高（見表2）。HPV陽性年齡同樣主要集中在44歲以下，以35～44歲最為顯著，該年齡段是HPV感染高危人群。部分患者同時存在高危基因、低危基因兩組HPV亞型和多個亞型HPV感染。

表1 1080例標本HPV高危型基因組檢測結果（陽性例數）Tab.2 Testing results of HPV high－risk genes in 1080cases specimens（positive humber of cases）

表2 1080例標本HPV低危型基因組檢測結果（陽性例數）Tab.2 Testing results of HPV low－risk genes in 1080cases specimens（positive humber of cases）

對1080例標本HPV基因亞型數目進行統計，HPV基因亞型單項陽性237例（21.94%），兩項陽性57例（5.28%），三項陽性20例（1.85%），四項陽性1例（0.09%）（見表3）；單個HPV基因型別陽性病例最高，其次兩個基因型別陽性較高，而3個基因以上陽性病例明顯減少。HPV陽性年齡主要集中在44歲以下253例（80.3%），其中以35～44歲最為顯著，162例（51.4%）。

表3 1080例標本HPV基因數目檢測結果（陽性例數）Tab.3 Testing results of HPV gene numbers in 1080cases specimens（positive humber of cases）

對1080例檢測發現的315例HPV陽性者進行液基細胞學檢查，細胞學診斷陽性者146例，占13.52%，其中未明確診斷意義的不典型鱗狀細胞（ASC－US）93例、LSIL 35例、HSIL 8例、SCC 2例、不典型腺細胞（AGC－US）8例。所有細胞學陽性病例行陰道鏡下定位活檢，結果顯示，活檢組織HPV陽性133例，符合率為91.10%；發現CIN 35例，其中CINⅠ23例，CINⅡ4例，CINⅢ8例；發現癌變5例，其中SCC 3例，腺癌1例，原位癌1例；所有CIN和癌變患者組織學標本行HPV檢測，結果發現全部HPV感染，并且以HPV16（26例）和 HPV58（12例）基因型別為主，其余HPV18和HPV52基因型別各1例。

3 討論

宮頸癌是一種嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，發病率在女性惡性腫瘤中居第2位，在一些發展中國家和地區仍居第1位［4］。現已明確HPV感染是宮頸癌發生的主要病因［5］，并且HPV的感染使宮頸癌的相對危險性增加250倍［6］，因此HPV檢測目前已作為宮頸癌初篩的重要手段之一。對本地區1080例標本HPV基因亞型的研究，發現比較常見的基因亞型是HPV16、HPV58和HPV18型，并且HPV58的感染率超過了 HPV18；這與Lee等［7］對南韓地區患者進行HPV分型研究的結果以及日本學者的研究相符合；與IARC［8］近年公布的15種最常見的 HPV亞型中，以HPV16感染率最高，HPV18次之不相符合，從而證實了HPV感染存在地區差異。此外，研究還發現本地區HPV33的感染率也較高，而HPV33亞型感染在我國報道較少；HPV感染以單項基因為主，發生CIN和癌變患者與HPV16、HPV58感染密切相關。TCT檢查國內外已普遍采用TBS分類系統，該系統比傳統的宮頸刮片細胞學檢查的巴氏5級分類法具有更嚴格的標準，又能很好地反應癌前病變，并且陽性率較高，因此TCT檢查值得推廣應用。本研究證實，HPV陽性年齡主要集中在44歲以下，以35～44歲最為顯著，該年齡段是本地區HPV感染高危人群；因此進行HPV、TCT檢查并聯合陰道鏡活檢十分重要；只有做好HPV、TCT檢查并聯合陰道鏡活檢篩查工作，才能早期發現、早期診斷和早期干預宮頸的癌前病變，從而有效預防宮頸癌發生，降低宮頸癌的發病率和死亡率。

［1］吳有利，陸學東，劉鍵，等.膜雜交多重檢測技術在HPV基因分型中的應用［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2005，25（12）：1048.

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［3］Solomon D，Davey D，Kurman R，et al.The 2001Bethesda System：terminology for reporting results of cervical cytology［J］.JAMA，2002，287（16）：2114－2119.

［4］Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Estimating the world cancer burden：Globocan 2000［J］.Int J Cancer，2001，94（2）：153－156.

［5］廖丹梅，黃明春，李惠珍，等.TCT聯合 HPV－DNA檢測在宮頸病變中的診斷價值［J］.廣西醫科大學學報，2008，25（1）：58－59.

［6］李琳，張繼勤，莊蘇陵，等.宮頸刮片陰道鏡及HPV檢測在宮頸癌篩查中的應用［J］.腫瘤基礎與臨床，2007，20（1）：58－59.

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［8］Franceschi S.The IARC commitment to cancer prevention：the example of papillomavirus and cervical cancer［J］.Recent Results Cancer Res，2005，166：277－297.