?；撬峤档透咛钦T導(dǎo)的視網(wǎng)膜谷氨酸興奮性及其機(jī)制

曾凱宏，楊詠濤，余雪梅，王靜，崔越

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 · 四川省人民醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，四川 成都 610072）

谷氨酸是哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，但是視網(wǎng)膜中過量的谷氨酸積聚會(huì)引起谷氨酸興奮毒性。近年來一些研究報(bào)道，視網(wǎng)膜中谷氨酸濃度增加與糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）密切相關(guān)，盡管DR時(shí)引起視網(wǎng)膜谷氨酸積聚的詳細(xì)機(jī)制還不清楚，但尋找一種方法清除視網(wǎng)膜細(xì)胞外空間中過量的谷氨酸對(duì)保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的正常功能具有十分重要的作用［1］。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中的主要膠質(zhì)細(xì)胞，其一個(gè)重要的生理功能是攝取和清除突觸釋放的谷氨酸。Müller細(xì)胞表達(dá)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glutamate transporters，GLAST）和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS），細(xì)胞外的谷氨酸通過GLAST攝入Müller細(xì)胞，在Müller細(xì)胞內(nèi)通過GS轉(zhuǎn)化為無毒性的谷氨酰胺釋放出來［2，3］。糖尿病狀態(tài)下由于血－視網(wǎng)膜屏障的破壞，血管中大量谷氨酸漏出，加重視網(wǎng)膜谷氨酸興奮性。?；撬崾侵匾囊曈X保護(hù)因子，但牛磺酸減輕高糖引起的視網(wǎng)膜谷氨酸興奮性的機(jī)制尚不明確［4－6］。我們通過觀察25 mmol／L葡萄糖干預(yù)下Müller細(xì)胞中GLAST和GS表達(dá)及活性改變，以及牛磺酸對(duì)其調(diào)節(jié)作用，以探討?；撬岬挚垢咛钦T導(dǎo)的視網(wǎng)膜谷氨酸興奮性及其機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

出生后3～5d的新生Sprague－Dawley（SD）大鼠7只，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。?；撬幔罕本┦兰o(jì)維他生物技術(shù)有限公司，純度＞95%；胎牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：蘭州民海；Dubecco標(biāo)準(zhǔn)改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium／F12，DMEM／F12）、胰蛋白酶：美國 Gibco公司；D－葡萄糖（D－glucose）：Sigma公司；抗GS一抗：Sigma公司；抗波紋蛋白（vimentin）一抗：武漢博士德；抗GLAST一抗：Sigma公司；熒光二抗羅丹明、異硫氰酸熒光素（fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）購于北京中杉生物技術(shù)有限公司，Hoechst熒光染料為北京碧云天生物公司產(chǎn)品，RT－PCR檢測(cè)試劑盒：羅氏公司，L－［2，3－3H］－谷氨酸：Sigma公司，GS檢測(cè)試劑盒：Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠視網(wǎng)膜 Müller細(xì)胞的純化培養(yǎng)及鑒定 出生后3～5d的新生SD大鼠，用750mL／L酒精浸泡消毒同時(shí)麻醉，無菌條件下取眼球，雙抗磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗數(shù)遍，小心剝離視網(wǎng)膜，加入5g／L胰蛋白酶，37℃消化20～30min，充分吹打，加入含200mL／L血清的DMEM／F12培養(yǎng)基終止消化，不銹鋼網(wǎng)過濾，1000 r／min離心3～5min，DMEM／F12培養(yǎng)基重懸，離心，反復(fù)2次。去上清后加入含200mL／L血清的DMEM／F12培養(yǎng)基制細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞密度為3×108個(gè)／L，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中。9d后，將培養(yǎng)瓶密封，放入恒溫?fù)u床，200r／min搖24h進(jìn)行Müller細(xì)胞純化。細(xì)胞形態(tài)一致后，1∶2傳代分瓶，第2／3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞傳代后接種于預(yù)置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，24h完全伸展后進(jìn)行鑒定。細(xì)胞鑒定采用Müller細(xì)胞標(biāo)志物GS、GLAST和vimentin聯(lián)合，免疫細(xì)胞熒光雙標(biāo)鑒定。

免疫細(xì)胞化學(xué)雙染步驟為：細(xì)胞爬片以40g／L多聚甲醛固定30min，PBS漂洗5min×3次，用含10g／L BSA、5mL／L TritonX－100的PBS緩沖液孵育30min，同前漂洗后，用含50～100mL／L正常羊血清的PBS緩沖液孵育10min，加1∶2000稀釋的抗GS一抗或抗GLAST一抗，4℃過夜，同時(shí)設(shè)PBS替代一抗的空白對(duì)照和正常羊血清替代一抗的替代對(duì)照，PBS漂洗后與羅丹明標(biāo)記的熒光二抗37℃孵育30min，PBS漂洗后加1∶200稀釋的抗vimentin一抗，37℃，2h，PBS漂洗后與FITC標(biāo)記的熒光二抗37℃孵育30min，PBS漂洗后加Hoechst熒光染料于37℃孵育5 min，PBS緩沖液漂洗后，900mL／L甘油封片，激光共焦顯微鏡觀察照相。

1.2.2 高糖模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，棄掉含血清的培養(yǎng)液，換無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，再換成含不同濃度葡萄糖和?；撬崤囵B(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分10組，分別是：5mmol／L葡萄糖培養(yǎng)組（正常對(duì)照組），5mmol／L葡萄糖＋0.1mmol／L?；撬崤囵B(yǎng)組，5mmol／L 葡萄糖＋1mmol／L?；撬崤囵B(yǎng)組，5mmol／L葡萄糖＋10mmol／L牛磺酸培養(yǎng)組（不同劑量牛磺酸對(duì)照組），25mmol／L葡萄糖培養(yǎng)組（高葡萄糖組），25mmol／L葡萄糖＋0.1mmol／L?；撬崤囵B(yǎng)組，25mmol／L葡萄糖＋1mmol／L牛磺酸培養(yǎng)組，25mmol／L 葡 萄 糖 ＋10mmol／L 牛 磺 酸 培 養(yǎng) 組，5mmol／L＋20mmol／L甘露醇組（甘露醇對(duì)照組）。

1.2.3 RT－PCR檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜 Müller細(xì)胞 GLAST、GS的表達(dá) 大鼠脫臼斷頭處死，取眼球，分離視網(wǎng)膜，用Tripure試劑提取總RNA。核酸蛋白定量儀檢測(cè)RNA純度及含量。取總RNA 3μg，加入Oligo（dT）18 0.5μg，加無菌水至11μL，75℃水浴5min，加5×反應(yīng)緩沖液4μL、10mmol／L dNTP 2μL、RNA酶抑制劑20U，加水至19μL，37℃水浴5min，加M－MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶200U，42℃反應(yīng)60 min，70℃放置10min制備cDNA。擴(kuò)增條件為β－肌動(dòng)蛋白（β－actin）FP1：TTGTAACCAACTGGGACGATATG

G，RP2：GATCTTGATCTTCATGGTGCTAG，退火溫度：63.5℃，產(chǎn)物長度764bp，GLAST：FP1：ACTTTGCCTGTC ACCTTCCG，RP2：ACTGCGTCTTGGTCATTTCG，退火溫度57.2℃，產(chǎn)物長度463bp，GS：FP1：CTACATGCCCAGT CAGTATAACGC，RP2：AAGGCTCAGGTTCAATCTTCT CCA，退火溫度55.7℃，產(chǎn)物長度410bp。

1.2.4 Müller細(xì)胞對(duì) L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取的測(cè)定 將第2代 Müller細(xì)胞接種在24孔培養(yǎng)板中，密度為1×104個(gè)／ml，24h后將含血清的培養(yǎng)液棄掉，換用無血清的培養(yǎng)液，孵育24h后再棄掉培養(yǎng)液，按前述分組情況換為含有不同培養(yǎng)條件的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，于24 h后在培養(yǎng)液中加入0.5μCi／ml L－［2，3－3H］－谷氨酸，β－液體閃爍儀測(cè)定 Müller細(xì)胞對(duì)L－［2，3－3H］－谷氨酸的攝取，計(jì)算其3H放射性活度。

1.2.5 Müller細(xì)胞GS活性測(cè)定 分組后的細(xì)胞培養(yǎng)96h后，用GS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)GS活性，首先加入500μL 4－羥乙基 哌 嗪 乙 磺 酸 ｛2－［4－（2－h(huán)ydroxyerhyl）－1－piperazinyl］ethanesulfonic acid，HEPES｝－Tris緩沖液37℃孵育30min，然后加入反應(yīng)混合液，于37℃孵育15min，加入終止反應(yīng)液終止試驗(yàn)，樣品在冰上放置5min，離心除去沉淀蛋白，535 nm比色讀數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Müller細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

培養(yǎng)3d后，細(xì)胞貼壁緊，60%融合，形成集落，呈圓球形，部分細(xì)胞從圓球形底部伸出突觸；培養(yǎng)6天后，細(xì)胞大部分融合，胞體呈纖維形，核圓形或橢圓形；混養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)至第9d時(shí)，下層細(xì)胞鋪滿瓶底，細(xì)胞與細(xì)胞之間相互連接，形成“毯”狀。振搖24h后，可見清晰的長梭形細(xì)胞，基本沿同一方向生長，排列相對(duì)規(guī)則。在第3代細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞，鏡下可見清晰的細(xì)胞，形態(tài)不規(guī)則，梭形或多角形，核相對(duì)較大，胞漿淡，胞膜邊界清晰，貼壁緊。以 Müller細(xì)胞特征性標(biāo)識(shí)物GS、GLAST和vimentin聯(lián)合對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，98%以上的細(xì)胞兩種抗體染色呈陽性（圖1），提示為Müller細(xì)胞。

圖1 激光共焦顯微鏡下GS、GLAST和vimentin聯(lián)合鑒定Müller細(xì)胞Fig.1 Identification of Müller cells by GS，GLAST and vimentin under laser confocal microscopy

2.2 高葡萄糖和?；撬釋?duì)Müller細(xì)胞GLAST mRNA表達(dá)的影響

RT－PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，25mmol／L高糖培養(yǎng)組Müller細(xì)胞中GLAST mRNA表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），降低約70%；0.1mmol／L?；撬崽幚韺?duì)高葡萄糖組Müller細(xì)胞中GLAST mRNA表達(dá)量無明顯的影響作用（P＞0.05）；1.0和10.0mmol／L?；撬崽幚砜擅黠@增加高葡萄糖組 Müller細(xì)胞中GLAST mRNA表達(dá)量（P＜0.05）。?；撬釋?duì)照組和甘露醇對(duì)照組 Müller細(xì)胞中GLAST mRNA表達(dá)量與正常對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）（圖2）。

2.3 高糖和牛磺酸對(duì) Müller細(xì)胞 L－［2，3－3 H］－谷氨酸攝取活性的影響

25mmol／L高葡萄糖培養(yǎng)72h后，Müller細(xì)胞 L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取活性由（726±12）cpm／（min·mg protein）降為（352±10）cpm／（min·mg protein）（P＜0.05）；1.0和10.0mmol／L?；撬崽幚砜擅黠@增加高葡萄糖組Müller細(xì)胞L－［2，3－3H］－谷氨酸 攝取活性（P＜0.05），1.0 和 10.0 mmol／L?；撬崽幚斫M Müller細(xì)胞L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取活性分別為（720±10）和（734±9）cpm／（min·mg protein），0.1mmol／L?；撬崽幚韺?duì)高糖組 Müller細(xì)胞 L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取活性無明顯的影響作用（P＞0.05）；牛磺酸對(duì)照組和甘露醇對(duì)照組 Müller細(xì)胞 L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取活性與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

2.4 高葡萄糖和牛磺酸對(duì)Müller細(xì)胞GS mRNA表達(dá)及GS活性的影響

RT－PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，25mmol／L高糖培養(yǎng)組Müller細(xì)胞中GS mRNA表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；0.1、1.0和10.0mmol／L?；撬崽幚砜擅黠@增加高葡萄糖組Müller細(xì)胞中GS mRNA表達(dá)量（P＜0.05）。?；撬釋?duì)照組和甘露醇對(duì)照組Müller細(xì)胞中GLAST mRNA表達(dá)量與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4A）。圖4B顯示，25mmol／L高葡萄糖培養(yǎng)72h后，Müller細(xì)胞GS活性由（41.1±2.3）μmol／Lγ－谷氨酰羥肪酸（GHA）／（h·mg protein）降為（20.3±2.1）μmol／L GHA／（h·mg protein）（P＜0.05），1.0和10.0mmol／L?；撬崽幚砜擅黠@增加高葡萄糖組Müller細(xì)胞 GS活性（P＜0.05），1.0和10.0mmol／L牛磺酸處理組 Müller細(xì)胞 GS活性分別為（42.4±2.0）和（44.3±4.5）μmol／L GHA／（h·mg protein），0.1mmol／L?；撬崽幚韺?duì)高葡萄糖組Müller細(xì)胞GS活性無明顯的影響作用（P＞0.05），?；撬釋?duì)照組和甘露醇對(duì)照組 Müller細(xì)胞GS活性與正常對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）（圖4B）。

3 討論

谷氨酸是視網(wǎng)膜內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，突觸間過量的谷氨酸導(dǎo)致的興奮毒性為DR視網(wǎng)膜損傷機(jī)制之一，因此，控制突觸間隙的正常谷氨酸水平可抑制谷氨酸興奮毒性。Müller細(xì)胞因?yàn)榫哂蠫LAST和GS，能轉(zhuǎn)運(yùn)和降解谷氨酸。一些研究報(bào)道，糖尿病時(shí)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)和降解能力下降。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，DR時(shí)Müller細(xì)胞將谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺的能力下降65%，隨著Müller細(xì)胞轉(zhuǎn)化谷氨酸能力的下降，視網(wǎng)膜內(nèi)谷氨酸水平可上升1.6倍［1］。發(fā)生糖尿病后4周即檢測(cè)到大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的GLAST功能障礙，13周時(shí)，GLAST 水平下降了67%［2，3］。而 Müller細(xì)胞細(xì)胞膜的GLAST功能改變及細(xì)胞內(nèi)GS功能改變，都可引起Müller細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞外谷氨酸的能力受到破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸過量堆積，引起神經(jīng)元致死性死亡。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，25mmol／L高葡萄糖培養(yǎng)后Müller細(xì)胞中GLAST、GS mRNA表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），且高葡萄糖培養(yǎng)后，Müller細(xì)胞 L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取活性由正常組的（726±12）cpm／（min·mg protein）降為（352±10）cpm／（min·mg protein），GS活性由（41.1±2.3）μmol／L GHA／（h·mg protein）降為（20.3±2.1）μmol／L GHA／（h·mg protein），以上結(jié)果提示，視網(wǎng)膜 Müller細(xì)胞在體外高糖狀態(tài)下，其谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)和清除能力均明顯下降。而?；撬嶙鳛橐环N神經(jīng)保護(hù)因子，可明顯上調(diào)高糖組GLAST、GS mRNA表達(dá)量，增加 Müller細(xì)胞 L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取活性和GS活性。

綜上所述，?；撬崮芙档透咛且鸬囊暰W(wǎng)膜谷氨酸興奮性，其作用機(jī)制可能通過上調(diào)Müller細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)和降解能力，從而維持細(xì)胞外空間正常的谷氨酸濃度，該結(jié)果為牛磺酸用于防護(hù)DR提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖4 高葡萄糖和?；撬釋?duì)Müller細(xì)胞GS mRNA表達(dá)和GS活性的影響Fig.4 Effect of high glucose and taurine on GS mRNA expression and GS activity in Müller cells

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