培養Schwann細胞用于構建毛囊神經嵴干細胞定向分化飼養層

周紅利，張艷，任應博，林森＊

（1.成都醫學院人體解剖與組胚教研室，四川 成都 610083；

2.成都醫學院“發育與再生”四川省重點實驗室，四川 成都 610083；3.四川大學華西醫院臨床醫學院畢業后繼續教育部，四川 成都 610041）

毛囊神經嵴干細胞（neural crest stem cell，NCSC）定位于毛囊上部隆突區（bulge），具有緩慢的細胞增殖周期，超微結構為未分化狀態，是具有多向分化潛能的多能成體干細胞，可分化為皮脂腺、表皮細胞等細胞，具有可定向分化為Schwann細胞（Schwann cells，SCs）的能力，為神經修復帶來希望［1，2］。干細胞巢為毛囊干細胞提供免受如分化信號、凋亡信號等各種刺激的隱蔽環境，以維持干細胞特性和儲量。在干細胞巢的調控下，干細胞被周期性激活，產生祖細胞或短暫增殖細胞（transit amplifying cell，TA cell）。因此，維持干細胞靜止與激活狀態的平衡是干細胞巢的標志性功能［3］。毛囊干細胞一旦離開干細胞巢，隆突區來源的NCSC便增殖、分化或死亡。對干細胞的研究表明，在原代或初期培養階段，干細胞依賴于飼養層細胞及其分泌的生長因子，否則它們的存活率和克隆形成率不高，由此認為，飼養層條件是干細胞培養初期的一個關鍵因素。選擇合適的飼養層細胞、適當的細胞因子組合以及適量的劑量，進一步對干細胞的體外培養和擴增等方法進行優化，有望解決干細胞研究中存在的所用細胞純度低、難以獲得體外高純度、高活力的細胞等問題，為干細胞研究提供簡單可行的實驗室培養和擴增方法，建立經濟可靠的培養技術，從而為干細胞的臨床應用研究建立資源。

SCs包繞周圍神經軸突并形成髓鞘，是周圍神經系統（PNS）中特有的神經膠質細胞，是周圍神經再生過程中的重要種子細胞，并因此成為周圍神經系統損傷修復領域中的研究熱點。SCs能夠分泌多種神經營養因子，產生細胞外基質及細胞粘附分子，為軸突的再生提供良好的微環境，經基因轉染的SCs在脊髓損傷中有重要作用［4］。另外，研究表明將SCs移植到中樞神經系統（central nervous system，CNS）可以誘導CNS再生［5，6］。本研究以SCs作為干細胞分化的飼養層誘導NCSC定向分化，為神經再生提供可靠微環境，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物

SD乳鼠（5～7d齡）由四川大學華西醫學中心實驗動物中心（SPF）提供。

1.2 主要試劑和設備

胎牛血清（Gibco公司）、DMEM／F12培養液（Gibco公司）、2mg／ml四氮唑鹽（MTT）液（beyotime中國）、二甲基亞砜（DMSO，分析純）、0.25%胰酶（Sigma公司）、0.125%膠原酶（Sigma公司）、多聚賴氨酸（Sigma公司）；二抗熒光抗體（Invitrogen公司）；神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP）和鈣結合蛋白S100抗體（Santa Cruz公司）；ELISA試劑盒（BD公司）。防淬劑、封片劑（DAKO公司）；CO2培養箱（THERMO公司）、酶標儀（BIORAD公司）、解剖顯微鏡（Olympus公司）、相差顯微鏡（Olympus公司）、激光共焦顯微鏡（Olympus公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 原代NCSC培養、鑒定及飼養層誘導分化 參照張藝等［7］的培養方法，在解剖顯微鏡下，使用26號針頭將5～7 d齡的SD乳鼠單個觸須毛囊從唇部觸須皮片中分離。在添加青霉素和鏈霉素的D－Hanks液中漂洗2次，洗掉脂肪滴以及血漬。轉移到0.25%分散酶（dispase）中室溫孵2h。用含20%胎牛血清的DMEM／F12培養液抑制終止消化，在無菌D－Hanks液中漂洗2次，重新于解剖顯微鏡下分別將單個毛囊的結締組織鞘剝離，只保留含外根鞘、內根鞘、毛干和隆突區的裸毛囊。從每只鼠中分離40根左右，在超凈臺中將毛囊轉移到培養瓶中。放少量DMEM／F12培養基（3∶1）使裸毛囊能夠貼于瓶底，于37℃、5%CO2培養箱中翻轉培養4 h，之后使瓶中培養基達到3mL，常規方式培養。分別于培養的第1～8d觀察毛囊隆突區細胞的生長形態以及特性，測量原代細胞克隆的直徑，取平均值。加入含10ng／ml堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth facfor，bFGF）、10ng／ml表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）的神經嵴干細胞培養液，調整細胞濃度，以1×105個／ml接種于24孔培養板。視細胞的生長情況，隔日補充添加以上生長因子或每2d半量換液。培養24h后取3孔細胞行常規細胞計數，求平均值，然后每24h按照同樣的方法操作計數，根據計數的結果取對數繪制生長曲線。以神經嵴干細胞特異性標志物nestin和p75NTR鑒定該細胞是否為NCSC。1.3.2 原代Schwann細胞培養及飼養層條件選擇 參照文獻［8，9］的方法，取新生SD乳鼠，斷頭處死，75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下取出雙側臂叢及坐骨神經，置于無血清培養基的培養皿中，培養皿放在4℃冰塊上，去除表面的污血，在解剖顯微鏡下仔細剝離神經外膜及其粘連組織，剪成0.1～0.2mm大小的組織塊，移入含0.25%胰蛋白酶和0.125%膠原酶混合液的離心管，在37℃恒溫消化15～20min，用吸管輕輕吹打，待組織塊分散后以等量含20%FBS的DMEM／F12培養液中止消化，1500r／min下離心5min，加入適量含20%FBS的DMEM／F12培養液，種植于預先涂布有多聚賴氨酸的35mm培養皿中，置于37℃、5%CO2培養箱培養。種植24h后，更換含阿糖胞苷的20%FBS的DMEM／F12培養液，阿糖胞苷終濃度為5μg／ml，48h后更換含有20ng／ml bFGF的培養液。細胞遷移并長滿皿底后，將組織塊移入新培養皿中，反復3次后將得到的純化原代SCs放置于裝有5mL DMEM／F12培養液的培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.3.3 間接免疫熒光法檢測S100和GFAP表達以鑒定SCs及純度 參照文獻［10］的方法，反復傳代后，取對數生長期細胞，并用0.125%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。將SCs接種到預先經多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片上（12孔板），每孔加入2mL含10%FBS的DMEM／F12培養液，置CO2培養箱中培養。待細胞覆蓋玻片70%～80%時，棄去培養基加入冷丙酮固定10min后，將蓋玻片取出，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗3次，每次5min，然后滴加50μL／片GFAP和S100抗體（稀釋比例為1∶100），濕盒中4℃過夜；次日復溫后用PBS振洗3次（10min／次），避光加入熒光標記的IgG羊抗鼠抗體（Invitrogen），37℃孵育60min，PBS洗3次，每次5min，最后加入熒光染料Hochest33342染色5min，PBS洗2次，每次5min。在準備好的在載玻片上滴一滴防淬劑，約15μL，將蓋玻片有細胞的一面向下成45°扣在載玻片防淬劑上，趕走留下的氣泡封片。最后在激光共焦顯微鏡下，488nm的熒光下掃圖。在鏡下每張隨機選取5個視野，計數細胞總數和S100陽性細胞，并計算SCs純度。SCs純度＝S100陽性細胞／細胞總數×100%。期間，加入二抗熒光抗體及以后的實驗過程均要求避光操作。

1.3.4 MTT檢測飼養層SCs對培養基血清濃度的依賴性參照文獻［11］的方法。取對數生長期SCs，消化并稀釋至4×105個／mL的密度，然后轉移至75mL的培養瓶，于37℃、5%CO2培養箱中培養，24h后換液。待細胞長滿瓶底后，在培養瓶中加入0.125%胰蛋白酶3mL消化，在解剖顯微鏡下監測，當SCs突起回縮、突起形成的網絡斷裂時加含血清的培養液終止。以吸管輕輕吹打至單細胞懸液，1500 r／min離心5min，加入適量的DMEM培養液，以血細胞計數板于顯微鏡下計數，用含的10%FBS DMEM／F12稀釋至1.0×106個／ml細胞密度接種于96孔板，每孔200μL，約1.0×105個細胞，置37℃、5%CO2培養箱中培養。次日小心吸去培養液，設4個實驗組，每組6孔，即無血清組、MTT試劑組、含 5%FBS 的 DMEM／F12 組、含 10%FBS 的DMEM／F12組、含20%FBS的 DMEM／F12組。每孔加200μL相應的培養液置37℃、5%CO2培養箱繼續培養。48 h后每孔加入2mg／ml MTT 50μL，在37℃、5%CO2培養箱孵育4h后，輕輕吸去培養液，每孔加DMSO 150μL，置振蕩器上振蕩10min，在酶標儀波長為490nm波長處測量其吸光度（A）值，取平均值，同時繪制SCs生長曲線。

1.3.5 NCSC飼養層制備 待SCs長到鋪滿瓶底80%～90%時，加入含10～40mg／L絲裂霉素C的DMEM／F12培養液，在37℃孵箱培養2～16h后，用PBS蕩洗3次，使用MTT法測定絲裂霉素C對SCs存活的影響。獲取絲裂霉素C最適濃度后，利用0.25%胰蛋白酶消化細胞，以5×105個細胞接種到0.1%明膠包被的培養瓶中，24h后備用。用同一規格的培養皿，機械法將NCSC克隆切成3～16塊，轉移到鋪有飼養層的培養皿中，選擇最佳作用時間和濃度。

1.3.6 ELISA檢測SCs分泌的神經營養因子 取第3代SCs接種到96孔板，每孔加入細胞懸液200μL。培養5d后，將各孔加入收集好的培養液50μL與稀釋液50μL混勻后封口，室溫孵育2h。用洗滌液將各孔充分洗滌5次，用濾紙印干。每孔再加入酶標抗體工作液100μL，并重新封口。繼續室溫孵育1h后，同上，洗滌測試孔后，每孔加入底物液A和B共100 μL，室溫避光反應30min。最后，每孔加入100μL終止液混勻。用酶聯免疫監測儀檢測450nm處吸光度值。

2 結果

2.1 NCSC形態學觀察及鑒定

培養原代NCSC鏡下發現細胞呈鋪路石樣結構，核質比小，透亮，內容物少，細胞之間連接緊密，呈現集落樣干細胞樣形態（圖1）。細胞生長曲線分析顯示NCSC在培養的第4～5天達到高峰，隨后逐漸平穩下降（圖2）。經神經嵴干細胞特異性標志物nestin和p75NTR鑒定，該細胞為NCSC（圖3）。

2.2 SCs的形態學觀察及生長狀態

SCs原代細胞接種40～72h后，細胞從組織塊中爬出，鏡下細胞呈雙極長梭形，核卵圓居中，胞體較小細長，排列緊密（圖4）。傳代培養細胞形態均一，增殖旺盛，細胞生長曲線分析顯示SCs在培養的第6d達到高峰，隨后逐漸平穩下降（圖5）。

2.3 SCs標志物S100和GFAP的免疫組織化學鑒定

激光共焦顯微鏡下掃描，培養細胞多數為S100和GFAP陽性細胞（圖6），經計數，培養細胞中SCs純度為95%。

2.4 SCs對血清的依賴性

MTT比色試驗結果顯示，含0%和5%FBS培養液組的吸光度值與含10%和20%FBS培養液組相比顯著增高，0%和5%FBS培養液組的吸光度值差異無統計學意義（圖7）。

2.5 SCs飼養層條件

在2、4h時間點，10～40mg／L絲裂霉素C劑量對細胞存活無明顯影響；而在8、16h，SCs存活明顯下降，尤其是使用20和40mg／L劑量情況下（圖8）。為此選擇10mg／L絲裂霉素C處理2h，使SCs處于休克狀態，以建立飼養層。

圖3 NCSC細胞的形態及nestin和p75NTR鑒定Fig.3 Identification of NCSC by nestin and p75NTR

圖8 絲裂霉素C處理飼養層細胞的量效關系Fig.8 Dose－effect relationship by mitomycin C on treated Schwann cell（feed layer）

2.6 ELISA檢測飼養層SCs分泌細胞因子

在飼養層建立的0～8d，NGF和BDNF的水平呈現逐漸上升趨勢（圖9），其中NGF在0～4d間上升速度較快，以后趨于平穩；BDNF在0～3d間上升速度較快，以后趨于平穩。因此，種植NCSC可在飼養層建立后的第3d開始。

2.7 SCs與毛囊神經嵴干細胞共培養

利用3d的飼養層SCs對NCSC進行誘導，將NCSC克隆分散培養到SCs飼養層上。經過連續4d培養，發現NCSC受到飼養層影響，形態發生改變，由最初的鋪路石樣變為有短突起狀，細胞呈現近似梭形。激光共焦顯微鏡下掃描，培養細胞多數為S100和GFAP陽性細胞，可同時表達S100和GFAP（圖10）。

圖10 飼養層共培養NCSCFig.10 Coculture of feed layer cell and NCSC

3 討論

SCs的功能非常活躍，能分泌多種物質如分泌神經營養因子NGF、BDNF、CTNF、FGF等，其分泌物可促進PC12細胞分化，促進運動神經元存活，為再生提供先決條件；其產生的細胞粘附分子（Cell adhesion molecules，CAM）和細胞外基質成分（Extracellular matrix，ECM），不僅為軸突再生提供良好的環境，同時也引導軸突再生［12－15］。此外，SCs還能分泌細胞外基質，促進神經生長，參與基底膜構成，在血管生長和成熟中起著重要作用。本實驗利用SCs的生長和分泌特性，可定向誘導NCSC向神經膠質細胞分化。SCs體外培養，其生長情況與培養基中血清的濃度密切相關［16，17］。本研究發現，無血清培養基可作為SCs構建飼養層的最佳培養基，既保留了細胞活性，又避免了血清對干細胞分化的影響。在培養的前7d，SCs增殖情況穩定，這一發現更正了以往研究認為膠質細胞需有血清才能存活的結論，為進一步研究干細胞提供了有利工具。為摸索最適的制備飼養層的條件，我們采用不同濃度絲裂霉素C處理SCs，發現10mg／L的劑量為理想化條件，可使細胞穩定存活，但不增殖，為NCSC飼養層的構建創造了有利條件。在激光共焦顯微鏡下，SCs表達GFAP，進一步證實了本實驗培養純化的SCs具有一定活性。

為證實處于非增殖狀態的SCs仍然能夠分泌神經營養因子，我們采用ELISA檢測飼養層細胞的分泌情況，結果發現，雖然飼養層的SCs已停止增殖，但是仍具有分泌能力，可在培養的前7d穩定分泌NGF和BDNF，這個結果也為后續研究提供了有利條件。NGF是神經營養因子家族中最早發現、兼有神經元營養和促突起生長雙重生物學功能的一種細胞生長調節因子，對中樞和周圍神經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用。NGF除了保護周圍神經損傷后的上位脊髓神經元，以利軸突再生外，還具有促非神經組織的血管生成作用［18］。

SCs作為飼養層，與神經干細胞、成肌細胞、紋狀體組織等多種組織或細胞共培養。與單一的普通培養相比較，SCs促進了神經干細胞分化，并促進其生長；與成肌細胞混合移植，促進了成肌細胞的增殖和分化，可提高成肌細胞移植后的融合性；促進了共培養紋狀體神經突起的生長及細胞的遷移，為神經退行性疾病的移植治療提供了新方法［19－22］。我們采用SCs作為飼養層的方法，共培養NCSC，能夠將其特異性地誘導分化為神經膠質細胞，表達S100和GFAP。GFAP是構成神經膠質細胞的主要細胞骨架蛋白，是SCs表面的標志蛋白，其表達的高低可以反映膠質細胞的功能狀態［23，24］。該研究結果為NCSC的組織工程應用提供了可靠穩定的基礎和來源。

目前，SCs正越來越多地被運用于神經修復、構建載體細胞等。本研究對SCs的原代培養技術方法及其生長活性做了綜合性的初步評價，并能夠誘導多能干細胞NCSC定向分化，為進一步實驗研究打下了良好的基礎。在臨床上，自體來源的NCSC避免了倫理和社會問題，理論情況下可以取之不盡用之不竭。因此采用定向誘導的NCSC細胞移植可應用于促進坐骨神經、脊髓、視神經的再生并修復中樞神經脫髓鞘損傷，前景非常廣闊。

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