不同種源丹參異地引種后質(zhì)量分析

楊新杰，萬德光，林貴兵，郭曉恒，劉濤，嚴(yán)鑄云

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610037；3.江西中醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004；4.成都大學(xué)，四川 成都 610106）

植物的次生代謝物是植物在長期進化中與環(huán)境（生物的和非生物的）相互作用的結(jié)果。次生代謝物在提高植物自身保護和生存競爭能力、協(xié)調(diào)與環(huán)境關(guān)系方面充當(dāng)重要的角色，其產(chǎn)生和變化較初生代謝產(chǎn)物與環(huán)境有著更強的相關(guān)性和對應(yīng)性［1，2］。藥用植物的代謝產(chǎn)物除受遺傳因素的主導(dǎo)外，適宜的生長環(huán)境也是形成優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定中藥的必備條件［3］，因此，中藥的品質(zhì)不僅取決于其本身的遺傳特征，同時還受到藥用植物生長的生態(tài)環(huán)境和栽培方式的制約。

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，是常用中藥材，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效［4］。丹參的主要有效成分包括脂溶性丹參酮類和水溶性酚酸類化合物，二者均是丹參治療心腦血管疾病、感染性疾病、抗腫瘤和糖尿病等的物質(zhì)基礎(chǔ)［5－8］。丹參分布較廣，生態(tài)適應(yīng)性強，又具有多道地性，許多學(xué)者圍繞丹參地理差異和遺傳多樣性開展了大量的研究工作，但未能說明引起丹參質(zhì)量差異的原因究竟是遺傳因素還是環(huán)境因素飾變的結(jié)果。我們采用異地引種的方法，分析不同種源丹參在四川中江石泉引種栽培后的質(zhì)量變化，探討遺傳因素和環(huán)境因素對丹參質(zhì)量的影響，為丹參資源的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 種源來源 種源為2007年11月在丹參各主產(chǎn)區(qū)采集栽培或野生丹參的根及根莖（產(chǎn)地情況見樣品測定項），樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)鑄云教授鑒定為丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的根及根莖。采用分批移栽。

1.1.2 栽培地的基本情況 移栽地點為丹參栽培歷史悠久的四川中江縣石泉鄉(xiāng)，北緯30°57′04″，東經(jīng)104°35′10″。中江縣地處四川盆地中央丘陵西部低山丘陵地帶，屬中亞熱帶濕潤氣候區(qū)，年平均氣溫16.7℃，1月平均氣溫5.3℃，7月平均氣溫26.4℃，無霜期長。于2008年3月份進行引種栽培，栽培密度為20cm×30cm。

1.1.3 樣品的采集和處理 于2009年3月份同時采挖，樣品采集后經(jīng)常規(guī)加工處理。

1.1.4 主要儀器及試藥 Waters－2695型高效液相色譜儀：Waters－2996型紫外檢測器和Empower色譜工作站（Waters公司）；電子天平（Made by Sartorius BP121S）；BRANSON SB－2200型超聲儀。

對照品：丹參酮IIA（批號110766－200417）、隱丹參酮（批號0852－9902）、原兒茶醛（批號110810－200506）、丹參素（批號110855－200508）、丹酚酸B（111562－200605）、咖啡酸（批號110885－200102）均購自中國藥品生物制品檢定所。迷迭香酸（批號080406）、丹酚酸 A（批號080412）、丹參酮I（批號071106）、二氫丹參酮I（批號080319）均購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。

試劑：乙腈為色譜純，二甲亞砜、甲醇、甲酸等均為分析純，水為去離子重蒸水。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Welchorm C18柱（4.6mm ×250 mm，5μm，美國 Welch公司）。流動相：A相為水－乙腈－甲酸（90∶10∶0.4），B相為乙腈，梯度洗脫：A：0～40min 100%～70%，40～50min 70%～40%，50～70min 40%～15%；B：0～40min 0～30%，40～50min 30%～60%，50～70min 60%～85%。流速：1.0mL／min；進樣量：20μL；柱溫：室溫；檢測波長：270nm。

1.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品置棕色量瓶中，以甲醇為溶劑，配制成單組分對照品溶液，再配制混合對照品溶液，其中含二氫丹參酮Ⅰ86.35μg／ml、隱丹參酮90.48μg／ml、丹參酮Ⅰ 130.00μg／ml、丹參酮ⅡA 180.65 μg／ml。丹參素鈉330.00μg／ml、原兒茶醛48.65μg／ml、咖啡酸54.00μg／ml、迷迭香酸458.36μg／ml、丹酚酸B 7 200.00μg／ml、丹酚酸 A 52.48μg／ml。

1.2.3 供試品溶液的制備 取過三號篩后的丹參藥材粉末0.5g，精密稱定，置7mL具塞離心管中，精密加入含40%二甲亞砜（DMSO）的75%甲醇溶液5mL，密塞，過夜，超聲提取30min，冷卻后以12 000r／min轉(zhuǎn)速離心5min，取其上清

液置于10mL容量瓶中；重復(fù)2次，合并兩次上清液，定容于10mL容量瓶中，加含40%二甲亞砜的75%甲醇溶液至刻度，搖勻，備用。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取上述混合對照品溶液1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μL，按確定色譜條件進樣，測定峰面積，各對照品分別以進樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸，以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 10個有效成分的線性關(guān)系Tab.1 Linearing of ten active ingredients

1.2.5 丹參10個有效成分的聚類分析 用SAS統(tǒng)計軟件中系統(tǒng)聚類法（Hierarchical cluster analysis）的離均差平方和法（Ward法），以丹參中10個有效成分的含量為變量對不同產(chǎn)地的丹參進行聚類分析，（0－1）標(biāo)準(zhǔn)化處理，繪制聚類分析結(jié)果圖，衡量樣品之間的親疏程度。

2 結(jié)果

2.1 樣品測定結(jié)果

取不同種源丹參藥材，按供試品制備方法處理，進樣20 μL分析，結(jié)果見表2。

2.2 丹參10個有效成分的聚類分析

聚類分析結(jié)果顯示，根據(jù)10個有效成分含量，丹參樣品按產(chǎn)地可分為兩組（圖1），第一組包括安徽亳州十八里鎮(zhèn)、山西襄汾、河南靈寶、江蘇贛榆、河北安國、陜西商洛、四川中江石泉鄉(xiāng)、四川中江石埡鄉(xiāng)、山西曲沃、江蘇射陽、河南民權(quán)、四川中江古店鄉(xiāng)、安徽亳州五馬鎮(zhèn)、山東平邑、山西芮城、山東日照、河南欒川、山東臨朐、陜西藍(lán)田。主要包括安徽、山西、江蘇、陜西、四川、河南的部分地區(qū)，該組樣品的脂溶性成分含量相對較高，水溶性成分相對較低。第二組包括山東沂南、河北行唐、河南鄧州、河南欒川、山東日照、山東萊蕪、四川中江集鳳鎮(zhèn)、河南方城、河南盧氏。主要包括山東、河北、四川中江集鳳鎮(zhèn)及河南的大部分地區(qū)，該組樣品的水溶性成分含量相對較高，脂溶性成分相對較低。

同樣根據(jù)10個有效成分含量，全國丹參樣品四川中江引種后按產(chǎn)地也可分為兩組（圖2），第一組包括安徽毫州十八里鎮(zhèn)、江蘇贛榆、四川中江石泉鄉(xiāng)、山西曲沃、山西襄汾、河南靈寶、四川中江石埡鄉(xiāng)、江蘇射陽、安徽毫州五馬鎮(zhèn)、河南民權(quán)、四川中江古店鄉(xiāng)、山東沂南、河北行唐、河南欒川、河北安國、陜西商洛、山西芮城、陜西藍(lán)田，主要包括安徽、江蘇、山西、河北、河南的部分地區(qū)。第二組包括山東平邑、山東日照、山東萊蕪、四川中江集鳳鎮(zhèn)、山東臨朐、河南欒川、河南鄧州、河南方城、河南盧氏，主要包括山東、四川中江集鳳鎮(zhèn)、河南的大部分地區(qū)。

表2 樣品測試結(jié)果（%）Tab.2 Determination of samples（%）

比較圖1和圖2，發(fā)現(xiàn)按樣品產(chǎn)地采集質(zhì)量較佳的山東平邑、山東臨朐的丹參在四川中江引種后質(zhì)量變?yōu)檩^次，山東沂南、河北行唐的丹參由引種前的質(zhì)量較次變?yōu)橐N后質(zhì)量較佳，其他產(chǎn)地的引種前后聚類分組未發(fā)生任何變化。

3 討論

通過對不同種源丹參在四川中江引種后10個有效成分進行測定，結(jié)果表明不同種源丹參引種后的有效成分含量仍存在差異，山東、河南、四川中江集鳳鎮(zhèn)等產(chǎn)地丹參在四川中江引種后，有效成分含量依然較高，我們認(rèn)為這類丹參的遺傳因素影響較大。而河北、山東的部分地區(qū)的丹參在四川中江引種后由引種前質(zhì)量較佳變?yōu)橐N后質(zhì)量較次，或者由較次變?yōu)檩^佳，我們認(rèn)為是環(huán)境因素作用的結(jié)果。

聚類分析是模式識別的一種，其基本思路是用“物以類聚”來衡量樣品之間的親疏程度，并以此來實現(xiàn)分類，廣泛用于研究對象的分類、鑒定［9－11］。為了比較全國各產(chǎn)地采集丹參和各產(chǎn)地丹參在四川中江引種后的10個有效成分變異情況，我們按產(chǎn)地對引種前和引種后分別進行了丹參10個有效成分的聚類分析，結(jié)果表明，全國丹參引種前3個野生藥材與山東和河南大部分產(chǎn)地、四川中江集鳳鎮(zhèn)栽培藥材聚為一類，與歷史上出現(xiàn)以河南、山東、四川為丹參道地產(chǎn)區(qū)相吻合，這些產(chǎn)地的有效成分含量較高。而引種后3個野生藥材仍與山東和河南大部分產(chǎn)地、四川中江集鳳鎮(zhèn)栽培藥材聚為一類，含量較高。我們認(rèn)為引種前后聚類分組未發(fā)生變化的產(chǎn)地丹參受遺傳因素影響較大，相反的，引種前后聚類分組發(fā)生變化的產(chǎn)地丹參受環(huán)境因素影響較大。

以上研究結(jié)果表明，丹參的質(zhì)量受到遺傳和環(huán)境飾變的雙重作用，環(huán)境的飾變也是影響丹參質(zhì)量的重要因素；丹參種質(zhì)以遺傳主導(dǎo)型為主，環(huán)境飾變型為輔。因此，在中藥品質(zhì)理論的遺傳主導(dǎo)和環(huán)境飾變論［3］指導(dǎo)下，進行藥用植物的環(huán)境因子研究，揭示影響藥材有效成分的主導(dǎo)因子及其與藥材質(zhì)量之間的關(guān)系，對確定中藥的適生區(qū)域具有重要指導(dǎo)意義。

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