高效液相色譜法結(jié)合支持向量機(jī)鑒別桑白皮

楊文宇，游元元，萬(wàn)德光

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，成都 610039；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 610075；3.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都 610083）

《中國(guó)藥典》所載的桑白皮為桑科植物桑Morus alba L.的已除去外層粗皮的干燥根皮［1］，但市場(chǎng)上其同屬植物較多，如魯桑 M.alba var.multicaulis、蒙桑 M.mongolica、華桑M.cathayana等［2，3］。目前桑白皮的鑒別主要依靠性狀鑒別和薄層鑒別［1］，但由于鑒別特征不甚明顯，往往難以準(zhǔn)確判斷藥材樣品是否源于 M.alba L.。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法能夠通過(guò)其給出的非線(xiàn)性、高維度的色譜峰指紋信息來(lái)綜合判斷樣品的屬性，是一種鑒別中藥的較好方法；但實(shí)驗(yàn)表明，由于桑白皮藥材特征因種質(zhì)、產(chǎn)地等因素而有較大變化，基于計(jì)算HPLC相似度的判別方法對(duì)某些桑白皮樣品的鑒別并不完全適用，有必要采用更好的數(shù)學(xué)分類(lèi)方法以提高鑒別能力。支持向量機(jī)是一種非常適合非線(xiàn)性、高維度、小樣本數(shù)據(jù)分類(lèi)的新方法［4－6］，其原理是根據(jù)各樣本的屬性，對(duì)于給定的樣本復(fù)雜數(shù)據(jù)（即多維向量）構(gòu)造一種決策函數(shù)，該函數(shù)能夠建立不同屬性樣本之間的分類(lèi)超平面并使之盡可能大，類(lèi)似于找到同一平面內(nèi)多個(gè)不同顏色的點(diǎn)之間的最大分類(lèi)界面。同一基原藥材的HPLC色譜峰之間的關(guān)系應(yīng)當(dāng)存在一定規(guī)律，這一規(guī)律可能正好是與源于同屬其他基原藥材的重要區(qū)別點(diǎn)。理論上將反映桑白皮HPLC色譜峰之間相互關(guān)系的數(shù)據(jù)作為輸入向量，用支持向量機(jī)方法尋找分類(lèi)界面，應(yīng)當(dāng)能夠準(zhǔn)確鑒別桑白皮藥材的基原。基于該推論，我們對(duì)此進(jìn)行了探討。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試劑與儀器 乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；甲醇、乙醇、石油醚（60～90℃）、乙醚、磷酸均為分析純，成都科龍化工廠(chǎng)產(chǎn)品；水為超純水。

Dionex P680型HPLC儀（美國(guó)戴安公司）：P680泵、UV D170U紫外檢測(cè)器、TCC－100柱溫箱、ASI－100自動(dòng)進(jìn)樣器、Chromeleon色譜工作站。BP 1215電子天平（德國(guó)賽多利斯公司，d＝0.1mg），Rios純水器（密理博上海貿(mào)易有限公司），AS5150BD－I超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.1.2 藥材 共收集11批桑白皮藥材（表1），參照文獻(xiàn)［7］的方法鑒定種質(zhì)不清的藥材。表中幾種雜交桑的基原：嘉陵16號(hào)為西慶一號(hào)×育二號(hào)，西慶一號(hào)為引自日本的四倍體桑樹(shù)，基原不詳，育二號(hào)為湖桑 39號(hào)（M.alba var.multicaulis）×廣東荊桑（M.atropurpurea）；湘7920為中桑5801號(hào)×澧桑24號(hào)（M.albavar.multicaulis），中桑5801號(hào)為湖桑38號(hào)（M.alba var.multicaulis）×廣東荊桑（M.atropurpurea）。嘉陵20號(hào)為湘7920×西慶四號(hào)，西慶四號(hào)為桐鄉(xiāng)青（M.alba var.multicaulis）經(jīng)秋水仙堿誘變所得的四倍體植株。廣東荊桑M.atropurpurea在《中國(guó)植物志》［8］中已被合并于M.alba之中。

表1 桑白皮藥材樣品的來(lái)源Tab.1 Original plants of Cortex Mori Radicis samples

1.1.3 軟件 支持向量機(jī)軟件Libsvm 2.85（臺(tái)灣大學(xué)林智仁博士提供，http：／／www.csie.ntu.edu.tw／?jlin／libsvm／），腳本執(zhí)行程序Python 2.5（自由軟件，http：／／www.python.org／），數(shù)學(xué)繪圖軟件 Gnuplot 4.0（自由軟件，http：／／www.gnuplot.info／）。上述軟件均運(yùn)行在 Microsoft Windows XP Professional操作系統(tǒng)上。

1.2 供試品溶液的制備

取粉碎后的藥材10g，用乙醇回流提取，提取液回收乙醇后，懸浮于水中，用等體積石油醚萃取3次，棄去石油醚，換用等體積乙醚萃取3次，合并乙醚萃取液，回收乙醚，殘?jiān)眉状汲暼芙猓D(zhuǎn)移至100mL量瓶中并稀釋至刻度，取1.0mL，置10mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，作為供試品溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（2）（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.5%磷酸（B）；洗脫方式：梯度洗脫，梯度程序見(jiàn)表2。流速：0.8mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320nm；柱溫：25℃。進(jìn)樣量：10μL。

1.4 色譜峰的積分與預(yù)處理

設(shè)定各藥材HPLC圖譜中色譜峰積分的閾值為5.0（信噪比約為10／1），全部采用手動(dòng)積分以避免色譜工作站自動(dòng)積分時(shí)默認(rèn)參數(shù)導(dǎo)致的積分誤差。采用色譜峰積分值原始數(shù)據(jù)計(jì)算藥材相似度。在進(jìn)行支持向量機(jī)分類(lèi)時(shí)，以各樣本HPLC圖譜中峰面積最大者為參照峰，計(jì)算其圖中各峰與參照峰的比值，將所得數(shù)據(jù)用作支持向量機(jī)分類(lèi)器的輸入值。

表2 流動(dòng)相梯度程序Tab.2 The gradient elution scheme

1.5 相似度的計(jì)算

采用向量夾角余弦法［9］計(jì)算各藥材HPLC圖譜的兩兩相似度：將藥材A的各色譜峰面積作為n維向量（x1，x2，…xn），藥材B的各色譜峰面積作為n維向量（y1，y2，…yn），則A與B的相似性可用二者在幾何空間的向量夾角θ的余弦來(lái)度量越接近1，則A與B的相似性越大。

1.6 支持向量機(jī)分類(lèi)的處理方法

設(shè)定源于M.alba的藥材HPLC色譜峰面積數(shù)據(jù)集樣本的分類(lèi)屬性為1，非M.alba的樣本的分類(lèi)屬性為－1。上述藥材樣本共11個(gè)，將屬于M.alba的5個(gè)藥材樣本的HPLC圖譜分別兩兩相加（相加結(jié)果相當(dāng)于兩藥材供試品溶液混合后再進(jìn)樣分析的結(jié)果），得到另10個(gè)屬于M.alba的樣本；將屬于非M.alba的6個(gè)藥材樣本的HPLC圖譜分別兩兩相加，得到另15個(gè)屬于非M.alba的樣本。總樣本量為36個(gè)，隨機(jī)選擇25個(gè)樣本作為支持向量機(jī)訓(xùn)練樣本，另11個(gè)樣本作為測(cè)試樣本。

用Libsvm軟件對(duì)訓(xùn)練樣本的輸入值進(jìn)行機(jī)器學(xué)習(xí)，通過(guò)徑向基核函數(shù)構(gòu)造分類(lèi)決策函數(shù)從而建立分類(lèi)模型；在此過(guò)程中，采用網(wǎng)格搜尋和交叉驗(yàn)證方法搜索徑向基核函數(shù)的重要參數(shù)，即最優(yōu)值即懲罰因子c和徑向基系數(shù)γ，用Gnuplot軟件繪制交叉驗(yàn)證精度等高線(xiàn)［lg（c）－lg（γ）］以使參數(shù)尋優(yōu)過(guò)程直觀(guān)化。用該模型預(yù)測(cè)各測(cè)試樣本的分類(lèi)屬性，判斷其為1還是－1。具體運(yùn)算時(shí)用Python軟件在命令行調(diào)用Libsvm和Gnuplot程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC圖譜

11批桑白皮藥材乙醚部位的HPLC圖譜總體上具有一定的相互相似性（圖1），這應(yīng)當(dāng)與它們均源于Morus L.屬有關(guān)，但藥材之間的差異也很明顯。

圖1 11批桑白皮藥材乙醚部位HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of 11ether extract samples of Cortex Mori Radicis

2.2 藥材兩兩相似度

11批桑白皮藥材乙醚部位的HPLC圖譜的兩兩相似度見(jiàn)表3。可以看出，源于M.alba L.的5批藥材中，除新疆樣本與其他藥材樣本相似度較小外，另4個(gè)藥材樣本的兩兩相似性均在90%以上。但非M.alba L.的藥材樣本也有一些與源于M.alba L.的藥材的相似性較高，如荷花池樣本與A2樣本、湖南樣本與A1樣本、潼南樣本與漢中樣本等的相似度均高于90%。因此，通過(guò)相似度分析并不能完全、準(zhǔn)確地判斷桑白皮藥材是否來(lái)源于M.alba L.。

表3 11批桑白皮藥材乙醚部位HPLC圖譜的兩兩相似度Tab.3 The pairwise similarities of HPLC profiles of 11ether extract samples of Cortex Mori Radicis

2.3 支持向量機(jī)分類(lèi)結(jié)果

參數(shù)尋優(yōu)過(guò)程的交叉驗(yàn)證精度等高線(xiàn)見(jiàn)圖2。圖中各曲線(xiàn)反映c和γ取不同值時(shí)，所建立的支持向量機(jī)分類(lèi)模型的準(zhǔn)確程度。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用于支持向量機(jī)分類(lèi)，其交叉驗(yàn)證精度在97%～100%范圍內(nèi)，這表明，對(duì)于根據(jù)HPLC數(shù)據(jù)判斷桑白皮是否屬于M.alba L.這一目的，用支持向量機(jī)方法建立分類(lèi)模型是非常適宜的。支持向量機(jī)運(yùn)算過(guò)程和結(jié)果見(jiàn)圖3，參數(shù)c的最優(yōu)值為2.0、參數(shù)γ（gamma，g）的最優(yōu)值為0.0078125，據(jù)此建立的支持向量機(jī)分類(lèi)模型的交叉驗(yàn)證精度為100%，用此模型對(duì)36個(gè)總樣本中11個(gè)測(cè)試樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果對(duì)樣本是否屬于M.alba L.的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為100%。上述36個(gè)總樣本中，隨機(jī)重新挑選樣本組成訓(xùn)練樣本和測(cè)試樣本，并按上述方法建模和預(yù)測(cè)，結(jié)果基本一致，所建模型對(duì)測(cè)試樣本均能達(dá)到100%的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率。

3 討論

支持向量機(jī)方法是一種“黑箱”方法，它只根據(jù)給定的樣本數(shù)據(jù)，即多維向量，找出處于分類(lèi)界面邊緣的各個(gè)向量，即支持向量，并據(jù)此確定最佳的分類(lèi)界面；但并不給出產(chǎn)生這種分類(lèi)的機(jī)理，因此并不給出能涵蓋樣本集中每一數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)公式。因此，該方法特別適合用于復(fù)雜性高而分類(lèi)特征不明顯的事物的分類(lèi)，而且，這一特點(diǎn)使得其不僅適合大樣本量數(shù)據(jù)的分類(lèi)，也能對(duì)小樣本量的數(shù)據(jù)給出良好的分類(lèi)結(jié)果，這也是我們采用支持向量機(jī)方法分析桑白皮的HPLC數(shù)據(jù)的原因。另外，支持向量機(jī)方法的樣本集中，增加或刪除一些屬于非支持向量的數(shù)據(jù)，對(duì)分類(lèi)模型不會(huì)產(chǎn)生影響，因此，該方法具有良好的魯棒性。本研究結(jié)果表明，用支持向量機(jī)方法，對(duì)桑白皮乙醚部位的HPLC數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)運(yùn)算，能夠建立一種判斷桑白皮是否屬于M.alba L.的分類(lèi)模型，所建模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率可達(dá)100%。該方法的分類(lèi)效果優(yōu)于相似度方法。

本研究所選桑白皮11批藥材的HPLC圖譜中，源于M.alba L.的5個(gè)藥材圖譜，其所檢出峰的數(shù)目、峰面積，相互之間均有較大差異，非M.alba L.藥材圖譜的情況也是這樣，而相似度計(jì)算結(jié)果也顯示難以按基原區(qū)分藥材，說(shuō)明直接比較峰數(shù)目和峰面積無(wú)法達(dá)到分類(lèi)目的。在進(jìn)行支持向量機(jī)分類(lèi)時(shí)，將各樣本色譜峰進(jìn)行歸一化處理，采用峰面積比值進(jìn)行運(yùn)算。峰面積比值反映了藥材中各化學(xué)成分含量的相對(duì)關(guān)系，據(jù)此用支持向量機(jī)方法建立的分類(lèi)模型能達(dá)到100%的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，即使對(duì)數(shù)據(jù)較為離群的新疆樣本也能給出準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)，表明同一基原樣本的一些主要化學(xué)成分之間的含量相對(duì)關(guān)系存在著一定的內(nèi)在規(guī)律。實(shí)驗(yàn)中按基原屬性分別對(duì)樣本HPLC圖譜兩兩相加，正是為了使這種內(nèi)在規(guī)律更加明顯，從而有助于提高支持向量機(jī)模型的準(zhǔn)確度。

市售桑白皮藥材的基原植物和種質(zhì)非常復(fù)雜［7，10］，致使評(píng)價(jià)不同基原、不同種質(zhì)和不同產(chǎn)地的桑白皮藥材的品質(zhì)變得十分困難。但根據(jù)中藥品質(zhì)“遺傳主導(dǎo)論”和“環(huán)境飾變論”的理論［11］，特定基原植物中藥材必定具有其特定的內(nèi)在品質(zhì)；而評(píng)價(jià)特定中藥材的內(nèi)在品質(zhì)，關(guān)鍵在于找到能充分揭示該中藥材內(nèi)在品質(zhì)的方法。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于HPLC分析所表征的不同基原、不同種質(zhì)和不同產(chǎn)地的桑白皮藥材整體化學(xué)成分的特征屬性，按支持向量機(jī)原理進(jìn)行分類(lèi)，是一種能準(zhǔn)確揭示桑白皮（M.alba L.）藥材內(nèi)在品質(zhì)的評(píng)價(jià)方法。本文結(jié)果為根據(jù)中藥品質(zhì)理論解決類(lèi)似復(fù)雜問(wèn)題提供了成功的范例。

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